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普洱茶優(yōu)勢(shì)菌株黑曲霉的分離及其功能和安全性研究

文檔作者：周才碧1, 陳文品1*, 吳鐘玲2, 張敏星1, 管俊嶺1, 李濤1, 穆瑞祿1 ( 文檔來(lái)源： 1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院茶葉科學(xué)系 2. 廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院		點(diǎn) 擊數(shù)：	更新時(shí)間： 2025年07月20日
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第6 卷 第3 期 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào) Vol. 6 No. 3
2015 年3 月 Journal of Food Safety and Quality Mar. , 2015
基金項(xiàng)目: 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31270725)
Fund: Supported by the National Natural Science Foundation of China (31270725)
*通訊作者: 陳文品, 副教授, 主要研究方向?yàn)椴枞~加工與安全。E-mail: cwptea@scau.edu.cn
*Corresponding author: CHEN Wen-Pin, Associate Professor, Tea Science Department, Horticultural College, South China Agricultural
University, No.483, Wu-Shan Road, Tian-He District, Guangzhou 510642, China. E-mail: cwptea@scau.edu.cn
普洱茶優(yōu)勢(shì)菌株黑曲霉的分離及其功能和
安全性研究
周才碧1, 陳文品1*, 吳鐘玲2, 張敏星1, 管俊嶺1, 李濤1, 穆瑞祿1
(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院茶葉科學(xué)系, 廣州 510642; 2. 廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院, 廣州 510642)
摘要: 目的了解黑曲霉在普洱茶渥堆發(fā)酵中的功能和安全性。方法 利用平板涂布法從普洱茶中分離、純
化得優(yōu)勢(shì)菌株S6, 通過(guò)分子鑒定為黑曲霉; 將黑曲霉按照懸浮液107 個(gè)/mL, 接種于潮水量35%的云南大葉種
曬青毛茶, 30 ℃、發(fā)酵25 d 制備得發(fā)酵茶樣, 按照GB 22111-2008 進(jìn)行感官、理化和安全性評(píng)價(jià)。結(jié)果 優(yōu)勢(shì)
菌株黑曲霉純種發(fā)酵的茶樣香氣濃純、湯色黑褐色、滋味較平和, 達(dá)到三級(jí)茶葉標(biāo)準(zhǔn)要求, 對(duì)比對(duì)照茶樣, 具
有茶褐素、紅度和黃度等變化較為深刻, 且赭曲霉毒素的含量為3.80 μg/kg, 低于國(guó)內(nèi)外限量。結(jié)論 優(yōu)勢(shì)菌
株黑曲霉可以作為發(fā)酵用菌種, 適于普洱茶的渥堆發(fā)酵, 發(fā)酵樣的安全性高。
關(guān)鍵詞: 普洱茶; 黑曲霉; 分離; 鑒定; 赭曲霉毒素; 安全性
Research on identification, function and safety of Aspergillus Niger, a
preponderant fungus during the fermentative process of Pu'er tea
ZHOU Cai-Bi1, CHEN Wen-Pin1*, WU Zhong-Ling2, ZHANG Min-Xing1, GUAN Jun-Ling1,
LI Tao1, MU Rui-Lu1
(1. Department of Tea Science, College of Horticulture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China;
2. Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute, Guangzhou 510642, China)
ABSTRACT: Objective To understand the function and safety of Aspergillus niger during the fermentative
process of Pu'er tea. Methods The preponderant fungus S6 was separated and purified from Pu'er tea in the
plate method, and it was Aspergillus niger through the use of molecular identification. Then Aspergillus niger,
following suspension 107/mL, was inoculated on the sun-dried green tea with 35% water, cultured for 25 d with
30 ℃, then the sensory, security, physical and chemical evaluations of fermented sample were operated
according to GB 22111-2008. Results The research results showed that compared with CK, the content of the
tea sample in fermentation of Aspergillus niger was the abrownins, redness and brightness. It was achieved the
third standard and was changed significantly in the fermented sample with sweet aroma, black brown tang,
velvety flavor, and the content of ochratoxin was 3.80 μg/kg under the limitation of home and abroad.
Conclusion Aspergillus niger is one of preponderant fungus during the fermentative process of Pu'er tea, and
plays a very important role to the formation of Pu'er tea quality with high safety.
KEY WORDS: Pu'er tea; Aspergillus niger; separation; identification; ochratoxin; safety
第3 期 周才碧, 等: 普洱茶優(yōu)勢(shì)菌株黑曲霉的分離及其功能和安全性研究 1007
1 引 言
普洱茶是云南大葉種曬青毛茶在濕熱作用和微
生物酶促作用下形成一種特種茶葉, 微生物的發(fā)酵作
用在云南普洱茶品質(zhì)形成中起決定性的作用, 是云南
普洱茶品質(zhì)形成的必要條件[1], 而黑曲霉(Aspergillus
niger)是普洱茶渥堆的發(fā)酵優(yōu)勢(shì)菌株之一[2]。
普洱茶具有降脂[3]、抗氧化[4]、抗過(guò)敏[5]、降血
糖[6]、抗腫瘤、抗病毒[7]、逆轉(zhuǎn)免疫衰老[8]等功能, 其
自身的衛(wèi)生品質(zhì)是決定普洱茶產(chǎn)品能否被安全食用、
能否作為商品的基本條件, 也是普洱茶產(chǎn)業(yè)可持續(xù)
發(fā)展的前提[9]。但普洱茶渥堆發(fā)酵過(guò)程是一個(gè)多種微
生物混合發(fā)酵體系, 有多種微生物毒素殘留的可能。
微生物毒素具有器官毒性、細(xì)胞毒性、分子毒性、
遺傳毒性和聯(lián)合毒素, 使機(jī)體產(chǎn)生免疫機(jī)能下降、生
長(zhǎng)受阻、生產(chǎn)性能減弱、抗病力降低、神經(jīng)毒性和致
癌性等危害[10], 甚至中毒致死, 而且一般微生物毒
素的化學(xué)結(jié)構(gòu)都很穩(wěn)定, 很難去除[11]。
赭曲霉毒素(ochratoxin, OCT)是由曲霉屬[12,13]或
青霉產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物, 在濕度較高的條件下才
能產(chǎn)生[14], 以O(shè)CTA、OCTB 和OCTC 等7 種結(jié)構(gòu)類(lèi)
似的化合物為主[15], AFT、AFB1 和OTA 在50℃溫水
中易浸出, 且表現(xiàn)在植物間相互傳遞和感染的現(xiàn)象
[16]。常污染糧食、花生、蔬菜、高粱[17]和咖啡豆等
農(nóng)作物[18-21], 及酵母片也有檢出[22], 且從市售的紅
茶和普洱茶中尚未檢測(cè)到曲霉菌株產(chǎn)生的赭曲霉毒
素A 和伏馬毒素[23]。OCT 主要侵害動(dòng)物肝臟與腎臟,
抑制動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂, 有致畸和致癌作用, IARC
將其定為2B 類(lèi)致癌物。谷物及其制品、豆類(lèi)及其制
品中OCTA 的限量不得超過(guò)5 μg/kg[24], 動(dòng)物飼料中
限量范圍在100~1000 μg/kg 之間, 根據(jù)世界衛(wèi)生組
織(WHO), OCTA 在谷物中的最高濃度應(yīng)為5 μg/kg。
目前, 對(duì)于普洱茶中黑曲霉的分離、鑒定和功能
性以及安全性方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。在普洱茶生產(chǎn)、
運(yùn)輸和陳化過(guò)程, 有曲霉屬菌株的參與, 普洱茶中存
在產(chǎn)生赭曲霉毒素的可能性, 因此對(duì)普洱茶優(yōu)勢(shì)菌
株黑曲霉的功能和安全性研究有特別重要的意義。
2 材料與方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1 儀器與設(shè)備
SW-CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)
備有限公司), 恒溫恒濕培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠), 立
式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司), RE-52A
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠), AB204-N 電子分
析天平, THA-82A 臺(tái)式恒溫震蕩儀, DGX-9143B-2 型
數(shù)碼電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海福馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),
SMART 生物顯微鏡( 重慶奧特光學(xué)有限公司),
HWS28 型恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司),
UV5100 型 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析一起有限
公司), 島津LC20A 型高效液相色譜儀等。
2.1.2 樣品與試劑
陳年普洱茶餅(七彩云南)、云南大葉種曬青毛茶
(云南勐宋)、桔青霉素和赭曲霉毒素標(biāo)樣(Pribolab),
以及查氏瓊脂培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基等。
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 菌株分離和鑒定
2.2.1.1 菌株分離和形態(tài)鑒定
陳年普洱茶餅, 制備10-2~10-7 稀釋梯度, 涂布分
離培養(yǎng)菌株, 純化保藏; 根據(jù)初分菌落的形狀、大小、
顏色和表面特征等形態(tài)特征, 結(jié)合《中國(guó)真菌志》對(duì)
獲得的各菌株進(jìn)行初步的形態(tài)鑒定。
2.2.1.2 分子鑒定
采用改良CTAB 法提取菌株DNA; 使用KOD高
保真DNA polymerase 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增目的片段, 進(jìn)行
3730XL 常規(guī)測(cè)序反應(yīng), 依照ABI 標(biāo)準(zhǔn)程序操作完成
全序列基因; 在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì), 確定菌株
的分類(lèi)地位, 構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。
2.2.2 發(fā)酵茶樣制備
制備107 個(gè)/mL 上述普洱茶中分離的優(yōu)勢(shì)菌株孢
子懸浮液, 接種于潮水量為35%的云南大葉種曬青
毛茶中, 在30 ℃氣候箱中培養(yǎng)25 d, 取出進(jìn)行45 ℃
干燥, 得到普洱茶發(fā)酵茶樣, 不加菌株發(fā)酵茶樣為對(duì)
照CK。
2.2.3 檢測(cè)方法
水浸出物, GB/T 8305-2002; 茶多酚, GB/T
8313-2002; 氨基酸, GB/T 8314-2002; 可溶性糖, 蒽
酮比色法; 茶色素, 系統(tǒng)分析法; 色差, 色差儀; 展
青霉素, GB/T 5009.185。
3 結(jié)果與討論
3.1.1 形態(tài)鑒定
采用涂布平板, 從陳年普洱茶餅中分離得到優(yōu)
勢(shì)菌株S6。S6 在查氏瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)迅速,
1008 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào) 第6 卷
28 ℃培養(yǎng)6 d, 菌落在20~30 mm 之間, 菌落較大, 地
毯式蔓延生長(zhǎng), 呈同心輪紋狀, 菌落正面黑色, 邊緣
產(chǎn)生白色次生菌絲, 反面灰黑色; 在顯微鏡下觀察,
菌絲有隔, 在菌絲的壁厚而膨大成“足細(xì)胞”, 產(chǎn)生分
生孢子梗, 無(wú)隔, 梗頂端膨大成球狀泡囊, 即為分生
孢子頭, 菌落和孢子形態(tài)見(jiàn)圖1。以上培養(yǎng)性狀和形
態(tài)特征符合黑曲霉的標(biāo)準(zhǔn)形態(tài), 初步命名為黑曲霉
S6(Aspergillus niger S6)。
3.1.2 S6 菌株進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建
以真菌基因組DNA 為模板, 利用通用引物擴(kuò)增獲
得ITS 基因的序列(如PCR 圖); 利用NCBI 中BLAST
搜索, 得到匹配度較高的已知序列, 利用MEGA 軟件
進(jìn)行多序列比對(duì)。結(jié)果顯示, S6 基因序列與已知的
Aspergillus niger(AB363747.1), 相似度達(dá)到99%, 與
Aspergillus nomius 和Aspergillus brasiliensis 的相似度相
對(duì)較低, S6 菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果構(gòu)建見(jiàn)圖2:
其具體分類(lèi)地位如下:
——界 真菌界Mycota
——門(mén) 子囊菌門(mén)Ascomycota
——綱 散囊菌綱Eurotiomycetes
——目 散囊菌目Eurotiales
——科 發(fā)菌科Trichocomaceae
——屬 曲菌屬Aspergillus
——種 黑曲霉Aspergillus niger
3.2 黑曲霉對(duì)普洱茶發(fā)酵茶樣的影響
3.2.1 黑曲霉發(fā)酵茶樣的感官品質(zhì)
由圖3 和表1 可以看出: 與CK相比, 黑曲霉發(fā)酵
茶樣附有棕、褐色菌體, 香氣濃純、有特殊的蘑菇香,
湯色黑褐色較渾濁, 滋味較平和、無(wú)刺激性、無(wú)特殊
的口感。結(jié)果表明, 黑曲霉菌株107 個(gè)/mL 孢子懸浮液
接種于潮水量35%的云南大葉種曬青毛茶中, 30 ℃發(fā)
酵25d, 菌落生長(zhǎng)旺盛, 對(duì)普洱茶影響較深刻。
3.2.2 黑曲霉發(fā)酵茶樣的成分變化
由表2 和圖3 可以看到: 與CK 相比, 黑曲霉發(fā)
酵茶樣水浸出物、茶多酚、可溶性糖、茶紅素、亮度、
的含量呈下降趨勢(shì), 變化幅度分別為6.23%、58.2%、
10.3%、59.4%、281.43%; 氨基酸、茶褐素、紅度和
黃度的含量呈上降趨勢(shì), 變化幅度為64%、633.2%、
552.5%和210.53%。pH 值變化不明顯。結(jié)果表明, 黑
曲霉渥堆發(fā)酵, 對(duì)普洱茶發(fā)酵茶樣的茶褐素、紅度和
黃度影響較深刻。
圖1 黑曲霉
Fig. 1 Aspergillus niger
圖2 PCR 和進(jìn)化樹(shù)
Fig. 2 PCR and evolutionary tree
第3 期 周才碧, 等: 普洱茶優(yōu)勢(shì)菌株黑曲霉的分離及其功能和安全性研究 1009
表1 發(fā)酵茶樣的感官審評(píng)
Table 1 The sensory evaluation of the fermented sample
菌株 外形 香氣 湯色 滋味 葉底
CK 墨色 清香 黃 澀 褐
S6 深棕褐色 蘑菇香 烏褐色、渾 濃厚、平和 褐
圖3 發(fā)酵茶樣及感官審評(píng)
Fig. 3 The fermented sample and the sensory evaluation
表2 發(fā)酵茶樣的成分分析
Table 2 The component analysis of the fermented sample
指標(biāo) CK 黑曲霉發(fā)酵茶樣
水浸出物% 48.16?1.61 45.18?1.51
茶多酚% 25.00?0.83 10.44?0.35
氨基酸% 2.54?0.08 4.39?0.15
可溶性糖% 5.35?0.18 4.82?0.16
赭曲霉毒素μg/kg 0.00?0.00 3.80?0.13
茶紅素 6.04?0.20 2.50?0.08
茶褐色 2.99?0.10 18.90?0.63
亮度 -7.01?0.23 -19.45?0.65
紅度 4.21?0.14 21.95?0.73
黃度 10.00?0.33 21.89?0.73
pH 7.07?0.24 7.20?0.24
注: 數(shù)據(jù)為均值?標(biāo)準(zhǔn)誤
3.2.3 黑曲霉發(fā)酵茶樣的安全性
利用HPLC 測(cè)定黑曲霉發(fā)酵茶樣中赭曲霉毒素
的含量, 由表2 知, 赭曲霉毒素的含量為3.80
μg/kg(低于國(guó)內(nèi)外限量5 μg/kg)。結(jié)果表明, 黑曲霉在
潮水量35%云南大葉種曬青毛茶中, 30 ℃發(fā)酵25 d,
發(fā)酵茶樣赭曲霉毒素低于國(guó)內(nèi)外限量, 安全性高。
4 結(jié) 論
黑曲霉在查氏瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)迅速,
28 ℃培養(yǎng)6 d, 菌落在20~30mm 之間, 菌落較大, 地
毯式蔓延生長(zhǎng), 呈同心輪紋狀, 菌落正面黑色, 邊緣
產(chǎn)生白色次生菌絲, 反面灰黑色; 在潮水量35%云
南大葉種曬青毛茶中, 30 ℃發(fā)酵25 d, 發(fā)酵茶樣附
有棕、褐色菌體, 香氣濃純、有特殊的蘑菇香, 湯色
黑褐色較渾濁, 滋味較平和、無(wú)刺激性、無(wú)特殊的
口感, 茶褐素、紅度和黃度等變化較為深刻, 且赭曲
霉毒素低于國(guó)內(nèi)外限量, 安全性高, 適于普洱茶的
渥堆發(fā)酵。
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toxins in food [S]. AQSIQ(General Administration of Quality
Supervision), 2011.
(責(zé)任編輯: 白洪健)
作者簡(jiǎn)介
周才碧, 研究生, 主要研究方向?yàn)椴?
葉加工與安全。
E-mail: teasky@foxmail.com
陳文品, 副教授, 主要研究方向?yàn)椴?
葉加工與安全。
E-mail: cwptea@scau.edu.cn

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