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化學(xué)發(fā)光生物傳感器法測(cè)定食品中有機(jī)磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留

文檔作者：王曉朋1, 曾梅1, 萬德慧1, 唐晗1, 趙彬媛2, 周雅倩2, 劉曉宇1, 2* 文檔來源： 1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 2. 環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,		點(diǎn) 擊數(shù)：	更新時(shí)間： 2025年06月24日
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上一篇：黃曲霉毒素危害和檢測(cè)方法研究進(jìn)展

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第5 卷 第12 期 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào) Vol. 5 No. 12
2014 年12 月 Journal of Food Safety and Quality Dec. , 2014
基金項(xiàng)目: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(20130504035)
Fund: Supported by the National Undergraduate Training Programs for Innovation and Entrepreneurship of Huazhong Agricultural University
(20130504035)
通訊作者: 劉曉宇, 博士, 教授, 博士生導(dǎo)師, 主要研究方向?yàn)槭称钒踩c農(nóng)業(yè)資源綜合利用。E-mail: liuxiaoyu@mail.hzau.edu.cn
*Corresponding author: LIU Xiao-Yu, Professor, College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070,
China. E-mail: liuxiaoyu@mail.hzau.edu.cn
化學(xué)發(fā)光生物傳感器法測(cè)定食品中有機(jī)磷與氨基
甲酸酯類農(nóng)藥殘留
王曉朋1, 曾 梅1, 萬德慧1, 唐 晗1, 趙彬媛2, 周雅倩2, 劉曉宇1, 2*
(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院, 武漢 430070; 2. 環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070)
摘要: 目的構(gòu)建一種用于檢測(cè)食品中有機(jī)磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的高靈敏度生物傳感器, 建立一種
用于測(cè)定食品中兩類農(nóng)藥殘留的新方法。方法以固定化乙酰膽堿酯酶(AChE)為識(shí)別元件與底物碘化硫代乙
酰膽堿(ATCI)特異性反應(yīng), 采用微流控芯片與化學(xué)發(fā)光儀作為檢測(cè)元件, 以魯米諾與鐵氰化鉀作為化學(xué)發(fā)光體
系, 通過流動(dòng)注射分析法來檢測(cè)農(nóng)藥殘留。結(jié)果當(dāng)有機(jī)磷類農(nóng)藥辛硫磷、敵敵畏、樂果濃度范圍分別在
0.1~10、0.08~10、0.8~15 μg/mL 時(shí), 相關(guān)系數(shù)分別為0.9923、0.9903、0.9904, 檢出限分別為0.047、0.054、0.388
μg/mL; 當(dāng)氨基甲酸酯類農(nóng)藥克百威、西維因、滅多威濃度分別在0.08~15、0.1~10、0.1~10 μg/mL 時(shí), 相關(guān)系
數(shù)分別為0.9926、0.9972、0.9944, 檢出限分別為0.049、0.051、0.080 μg/mL。傳感器性能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,
在最佳條件下對(duì)辛硫磷、敵敵畏、樂果、克百威、西維因、滅多威分別測(cè)定6 次, 結(jié)果RSD 值均小于7%, 精
密度較好; 以碘化硫代乙酰膽堿(ATCI)為底物, 連續(xù)通入魯米諾與鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光體系6 次, 所得RSD 值小
于8%, 穩(wěn)定性較好; 將實(shí)驗(yàn)制備的固定化AchE 儲(chǔ)存于pH 值為8.0 的磷酸鹽緩沖溶液中, 每隔10 d 測(cè)一次化
學(xué)發(fā)光峰值, 結(jié)果顯示兩個(gè)月內(nèi)相對(duì)活力下降為23%, 保存時(shí)間較長(zhǎng); 將傳感器用于測(cè)定包菜、蘋果樣品中的
農(nóng)殘, 添加回收率在90%~99%之間, 顯示精密度較好, 可用于測(cè)定食品中的農(nóng)藥殘留量。結(jié)論此生物傳感器
性能良好, 適用于測(cè)定食品中的有機(jī)磷與氨基甲酸酯類農(nóng)殘。
關(guān)鍵詞: 有機(jī)磷; 氨基甲酸酯; 乙酰膽堿酯酶; 微流控芯片; 化學(xué)發(fā)光; 生物傳感器
Determination of organophosphorus and carbamates pesticide residues in
foods by chemiluminescence biosensor
WANG Xiao-Peng1, ZENG Mei1, WAN De-Hui1, TANG Han1, ZHAO Bin-Yuan2,
ZHOU Ya-Qian2, LIU Xiao-Yu1,2*
(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;
2. Key laboratory of Environment Correlative Dietology, Ministry of Education, Wuhan 430070, China)
ABSTRACT: Objective To create a high-sensitivity biosensor for detecting organophosphorus and carbamates
pesticides in foods and establish a new method to determine these two kinds of pesticides. Methods
Immobilized acetylcholinesterase (AchE) was used as recognition element of the sensor, reacting specifically
with the substrate of acetylthiocholine iodide(ATCI), the micro-fluidic chip with CL analyzer was used as
4164 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào) 第5 卷
detecting element, and luminol-potassium ferricyanide system was used in chemiluminescence system.
Results When the concentration of proximal, dichlorvos, dimethoate ranging from 0.1~10, 0.08~10, and
0.8~15 μg/mL, respectively, the correlation coefficients were 0.9923, 0.9903, and 0.9904, and the detection
limits were 0.047, 0.054, and 0.388 μg/mL, respectively. When the concentrations of carbofuran, carbonyl, and
methomyl were ranging from 0.08~15, 0.1~10, and 0.1~10 μg/mL, respectively, the correlation coefficients
were 0.9926, 0.9972, and 0.9944, and the detection limits were 0.049, 0.051, and 0.080 μg/mL, respectively.
The evaluation of biosensor performance indicates good precision, when determining all 6 kinds of pesticides
under optimal conditions, RSD was below 7%; when the substrate of ATCI was injected into
chemiluminescence system 6 times discontinuously, RSD was below 8%, which indicated good stability;
immobilized AChE was stored in phosphate buffer(pH=8.0), detecting activity every 10 d, lasting for two
months, the relative enzymatic activity decreased only 23%, indicating a good storage stability; the biosensor
was used to detect samples of cabbage and apple, fortified recoveries were between 90%~99%. Conclusion
This biosensor has a good performance, therefore it can be used to determine pesticides in foods.
KEY WORDS: organophosphorus; carbamates; acetylcholinesterase; micro-fluidic chip; chemiluminescene;
biosensor
1 引 言
農(nóng)藥的應(yīng)用對(duì)于我國(guó)農(nóng)業(yè)的發(fā)展發(fā)揮了巨大的
作用, 有機(jī)磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥是其中的重要組
成部分。但是農(nóng)藥濫用的同時(shí)也對(duì)環(huán)境及人體帶來了
無法避免的危害。有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥俗稱
“神經(jīng)毒劑”, 能與人體興奮傳導(dǎo)物質(zhì)乙酰膽堿的分
解酶乙酰膽堿酯酶特異性結(jié)合, 使人痙攣, 嚴(yán)重則會(huì)
導(dǎo)致死亡[1]。因此, 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了農(nóng)藥使用的限量
標(biāo)準(zhǔn)[2], 而為了執(zhí)行這些標(biāo)準(zhǔn), 就必須有與之對(duì)應(yīng)的
檢測(cè)方法來測(cè)定農(nóng)藥殘留, 以判斷農(nóng)藥是否超標(biāo)。
現(xiàn)行的農(nóng)藥殘留測(cè)定方法有氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用
技術(shù)、高效液相色譜法、波譜法等[3,4], 但這些方法如
高效液相色譜法, 前處理較復(fù)雜, 專業(yè)性較強(qiáng), 設(shè)備
成本昂貴, 無法滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、快速檢測(cè)的目的。此
外還有免疫分析法、酶抑制率法、速測(cè)卡法[5-7]等快
速檢測(cè)方法, 也存在對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥敏感性差、性質(zhì)不
穩(wěn)定的缺點(diǎn)。而應(yīng)用生物傳感器[8]能夠彌補(bǔ)上述方法
無法滿足的現(xiàn)場(chǎng)、快速檢測(cè)的需求。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[9,10],
酶生物傳感器對(duì)有機(jī)磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測(cè)
有較好的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性。本研究將化學(xué)發(fā)光與固定
化乙酰膽堿酯酶[11,12]生物傳感器結(jié)合, 旨在構(gòu)建一
種快速檢測(cè)有機(jī)磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留的新
方法。
生物傳感器由識(shí)別元件、轉(zhuǎn)換元件及檢測(cè)元件構(gòu)
成, 由識(shí)別元件承擔(dān)特異性識(shí)別及反應(yīng)工作, 之后經(jīng)
換能元件將生化信號(hào)轉(zhuǎn)化為可識(shí)別的電信號(hào), 以達(dá)
到檢測(cè)的目的[13,14]。與傳統(tǒng)方法相比, 生物傳感器有
靈敏度高、選擇性好、分析速度快的特點(diǎn)[15]。
2 材料與方法
2.1 儀器與試劑
BPCL 微弱化學(xué)發(fā)光儀(中國(guó)科學(xué)院生物物理所);
HL-2 恒流泵(上海滬西分析儀器廠有限公司); 超聲
波清洗器SB-3200DT(寧波新芝生物科技股份公司);
組織搗碎機(jī)(PHILIPS); 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀
器廠); AB204-E 電子分析天平(上海天平儀器廠); 722
可見分光光度計(jì)(上海欣茂儀器有限公司); HH-4 恒
溫水浴(國(guó)貿(mào)電器有限公司); AB204-E 電子分析天平
(上海天平儀器廠); DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪
拌器(武漢科爾儀器設(shè)備有限公司)。
碘化硫代乙酰膽堿(ATCI, 純度99%, Sigma 公
司); 電鰻乙酰膽堿酯酶(AChE, Sigma 公司); 殼聚糖
(250g, 脫乙酰度96%, 分子量30 萬, 浙江金殼生物
化學(xué)有限公司); 鐵氰化鉀(500g, 純度≥99.0%, 天津
市塘沽區(qū)德華化學(xué)試劑); 魯米諾(1g, 純度99%, 美
國(guó)Sigma 公司); 解磷定(2-PAM, 25 g,純度99%, 美國(guó)
Sigma 公司); 敵敵畏標(biāo)液(100 μg/mL, 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保
護(hù)科研監(jiān)測(cè)所研制); 辛硫磷標(biāo)液(100 μg/mL, 農(nóng)業(yè)
部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所研制); 樂果標(biāo)液(100 μg/mL,
農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所研制); 西維因標(biāo)液(100
μg/mL, 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所研制); 克百威
第12 期 王曉朋, 等: 化學(xué)發(fā)光生物傳感器法測(cè)定食品中有機(jī)磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留 4165
標(biāo)液(100 μg/mL, 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所研制);
滅多威標(biāo)液(100 μg/mL, 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所
研制); 實(shí)驗(yàn)用蔬菜均購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)集貿(mào)市場(chǎng)。
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 芯片設(shè)計(jì)
微流控芯片是用于制作芯片的材料單晶硅、無定
形硅、玻璃、金屬和有機(jī)聚合物如環(huán)氧樹脂、聚甲基
丙烯酸甲脂(PMMA)、聚碳酸脂(PC)、和聚二甲基硅
氧烷(PDMS)等, 采用微細(xì)加工技術(shù)在芯片上構(gòu)建由
微通道、微反應(yīng)室、儲(chǔ)液池等功能單元構(gòu)成的微流路
系統(tǒng)[16,17]。高分子聚合物材料種類多, 加工成型方便,
價(jià)格便宜, 尤其是高聚物材料有良好的光學(xué)性質(zhì)、化
學(xué)惰性、電絕緣性和熱性能等, 使其在微流控芯片領(lǐng)
域的應(yīng)用具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)[18]。近年來高聚物為
材料的芯片應(yīng)用廣泛。
本研究以具有良好的綜合力學(xué)性能的高分子聚
合物聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)為原料, 采用銑床刻
蝕法刻蝕微通道。研究采用溶劑鍵合法鍵合芯片, 用
二氯乙烷和異丙醇(1:1, v:v)鍵合, 在顯微鏡下觀察鍵
合效果, 鍵合的微流控芯片平整光滑, 溝道通暢, 無
阻塞現(xiàn)象。且向微通道里注入品紅溶液, 結(jié)果溶液在
通道里流動(dòng)順暢, 顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)通道邊沿?zé)o滲
漏。微流控芯片如圖1 所示(單位: mm)。
圖1 聚甲基丙烯酸甲酯流通池示意圖
Fig. 1 Schematic diagram of polymethyl methacrylate
flow cell
2.2.2 化學(xué)發(fā)光生物傳感器流路設(shè)計(jì)
傳感器主要包括固定化酶柱和化學(xué)發(fā)光儀, 其
他輔助裝置包括蠕動(dòng)泵、八通閥、及微機(jī)等(如圖2)。
a: PBS; b: 碘化硫代膽堿底物溶液; c: 恢復(fù)劑2-PAM; d: 樣品; e:
鐵氰化鉀溶液; f: 魯米諾溶液; G 為八通閥; ER: 酶柱; P1、P2: 第1、
2 恒流泵; PMT: 光電倍增管; NHV: 負(fù)高壓; W: 廢液; PC: 計(jì)算機(jī)。
圖 2 化學(xué)發(fā)光生物傳感器流路圖
Fig. 2 The flow analysis system of chemiluminescence
biosensor
2.2.3 化學(xué)發(fā)光生物傳感器使用流程
首先進(jìn)行生物傳感器操作條件優(yōu)化, 在最優(yōu)條
件下進(jìn)行農(nóng)藥濃度檢測(cè)。傳感器的具體操作步驟如下:
1) 基線: 調(diào)節(jié)化學(xué)發(fā)光儀的負(fù)高壓為400 V, 開
啟恒流泵P1、P2, 使pH 為8.0 的磷酸鹽緩沖溶液a、
3 mmol/L 鐵氰化鉀溶液e 和0.6 mmol/L 魯米諾溶液
f 分別通過管道, 直到基線穩(wěn)定, 記錄發(fā)光強(qiáng)度為I;
2) 基礎(chǔ)酶活的測(cè)定: 旋轉(zhuǎn)八通閥G, 用0.05
mmol/L 的底物溶液b 替代磷酸鹽緩沖溶液a 通入管
路, 通入時(shí)間為70 s, 然后將三通閥重新轉(zhuǎn)回原來的
位置, 停止注入ATCh 的底物溶液, 通入磷酸鹽緩沖
溶液a, 記錄化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最低值I0, 即初始酶活;
3) 剩余酶活的測(cè)定: 待基線回到原發(fā)光強(qiáng)度后,
停止恒流泵P2, 調(diào)整八通閥, 停止注入磷酸鹽緩沖
溶液a, 通入樣品溶液d, 注入時(shí)間為20 min, 然后調(diào)
整八通閥G, 通入磷酸鹽緩沖溶液a, 以去除樣品溶
液。開啟泵P2, 重復(fù)步驟2)記錄的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最
低值Ii, 即為剩余酶活性;
4) 酶活恢復(fù): 停止恒流泵P2, 調(diào)整八通閥G,
使?jié)舛葹? mmol/L 恢復(fù)劑2-PAM 溶液c 過酶反應(yīng)器,
持續(xù)15 min, 旋轉(zhuǎn)八通閥, 通入磷酸鹽緩沖溶液a 5
min, 以去除2-PAM 溶液;
5) 復(fù)活后的酶活測(cè)定: 開啟恒流泵P2, 重復(fù)步
驟2)記錄化學(xué)發(fā)光最低值Ij, Ij-I 為相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度
值, 選取發(fā)光強(qiáng)度最大, 發(fā)光值波動(dòng)最小為最佳發(fā)光
條件;
6) 待檢測(cè)結(jié)束后用清水沖洗管道。
2.2.4 農(nóng)藥的測(cè)定
固定化酶的抑制效果用農(nóng)藥樣品溶液通過酶反
應(yīng)器前后的酶活差值Ii-I0 占基礎(chǔ)酶活I(lǐng)-I0 的百分比表
4166 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào) 第5 卷
示。其抑制率計(jì)算公式如下:
i 0
j 0
(%) 100
I I
I I
―
＝ ×
―
抑制率 (1)
0
(%) j 100 I I
I I
―
＝ ×
―
恢復(fù)率
(2)
其中I 為基線化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度; I0 為未通入農(nóng)藥時(shí)
的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度; Ii 為通入農(nóng)藥后的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度; Ij
為通入恢復(fù)劑后的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。
2.2.5 乙酰膽堿酯酶的固定及性能優(yōu)化
根據(jù)文獻(xiàn)[19-21], 并加以改正。首先配制18 mL 濃
度為5%的殼聚糖溶液(2.5％的乙酸溶液), 在錐形瓶
中加入50 mL 液體石蠟, 并加入1.5 mL 分散劑
Span-80, 在一定轉(zhuǎn)速下, 逐滴加入殼聚糖溶液, 繼
續(xù)高速攪拌使溶液液滴分散均勻, 然后逐滴加入0.8
mL 的戊二醛溶液(體積濃度為25%), 40 ℃水浴加熱
交聯(lián)反應(yīng)lh。反應(yīng)結(jié)束后, 使之與2.5 mol/LNaOH:
無水乙醇(v:v=l:1)溶液混合震蕩, 之后靜置, 去除油
層和水層, 用去離子水多次洗滌到中性, 最后將制得
的微球于4 ℃冰箱存放。
稱取0.500 g 殼聚糖微球加入2.0 mL 濃度為
0.4% GA 溶液充分震蕩15 min, 然后用蒸餾水反復(fù)
沖洗以除去多余的戊二醛溶液。稱取0.500 g 經(jīng)活化
后的微球, 加入1.2 U 的酶液, 4 ℃振蕩20 h, 用
PBS( 0.1 mol/L, pH7.5) 沖洗抽濾以除去表面吸附的
游離酶, 在4℃的PBS 中保存?zhèn)溆?。在此條件下測(cè)得酶
活回收率為75.35%, 連續(xù)測(cè)定6 次, RSD 值為5.76%。
參考Ellman[22]的方法, 并加以改善。移取3
mLPBS 溶液(0.1moL/L , pH=8.0)和0.015 g 固定化酶
于10 mL 比色管中, 混勻。30 ℃水浴30 min 后, 依
次加入100 μL DTNB (20 mmol/L)和20 μL ATCh (100
mmol/L), 混勻, 412 nm 處比色。靜置1min 后迅速讀
出吸光度, 取出比色皿慢慢搖動(dòng), 混勻反應(yīng)體系, 每
隔1 min 讀數(shù), 連續(xù)測(cè)定5 min。酶活力(U/g)用每g
酶溶液每1 min 水解底物的μmol 數(shù)表征。
U[μmol/(min·mg)]=V×A/(K×L×m)
式中:
V—反應(yīng)體系的總體積(mL);
A—吸光度隨時(shí)間的變化率(1/min);
L—測(cè)定酶活力時(shí)溶液的光徑長(zhǎng)度, 即比色皿光
程(mm), L=10;
K—消光系數(shù)[L/(mmol·mm)], K=1.36;
m—稱取的固定化酶的質(zhì)量(g)。
2.2.6 酶柱制備
將含有固定化酶的緩沖溶液搖勻, 用膠頭滴管
(酶活力在1 U 左右)吸取酶液, 加到4 cm×4 mm(i.d.)
的短塑料玻璃管中, 玻璃短管兩端拉成1 mm(i.d.)的
尖口。兩端用粘有篩絹(孔徑為0.05 mm)的帶孔橡皮
塞封住, 制得固定化酶柱。
2.2.7 樣品前處理
擦去樣品(包菜、蘋果)表面泥土, 取代表性可食
部分, 用組織搗碎機(jī)搗碎, 取樣品5 g, 置于50 mL燒
杯中, 加10 mL 丙酮超聲5 min, 不停振搖, 收集濾液;
然后向燒杯中再加入10 mL 丙酮, 振搖3 min, 合并濾
液, 移入裝有5 g 無水硫酸鈉的玻璃漏斗中, 吹干丙酮,
向離心管中加入10 mL 的磷酸鹽緩沖溶液(0.01 mol/L、
pH8), 取10 mL 上清液用微孔過濾器過濾后待用。
3 結(jié)果與分析
3.1 化學(xué)發(fā)光生物傳感器條件優(yōu)化
3.1.1 魯米諾濃度的影響
魯米諾作為發(fā)光劑, 直接影響著化學(xué)發(fā)光體系。本
研究考察了濃度為0.2~1.0 mmol/L的魯米諾溶液, 化學(xué)
發(fā)光趨勢(shì)如圖3 所示: 隨著魯米諾濃度的增大, 相對(duì)化
學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈增大趨勢(shì)。但是噪聲很大, 信噪比降低,
同時(shí)濃度為0.6 mmol/L時(shí)便可滿足測(cè)量所需的發(fā)光值。
綜合考慮以上因素, 選取魯米諾濃度為0.6 mmol/L。
圖3 魯米諾濃度對(duì)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響(n=3)
Fig. 3 The effect of luminol concentrations on relative
chemiluminescence intensity(n=3)
3.1.2 鐵氰化鉀濃度的影響
鐵氰化鉀在堿性條件下可氧化魯米諾產(chǎn)生化學(xué)
發(fā)光, 是影響化學(xué)發(fā)光體系的重要因素。本研究在
pH 值與魯米諾濃度一定的條件下, 考察了濃度為
第12 期 王曉朋, 等: 化學(xué)發(fā)光生物傳感器法測(cè)定食品中有機(jī)磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留 4167
1~6 mmol/L 鐵氰化鉀溶液, 化學(xué)發(fā)光趨勢(shì)如圖所示:
在濃度為3 mmol/L 時(shí)達(dá)到最大化學(xué)發(fā)光值, 故選擇
鐵氰化鉀的濃度為3 mmol/L。
圖4 鐵氰化鉀濃度對(duì)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響(n=3)
Fig. 4 The effect of potassium ferricyanide concentration on
relative chemiluminescence intensity (n=3)
3.1.3 流速的影響
在化學(xué)發(fā)光微流動(dòng)注射體系中, 試劑混合和反
應(yīng)速度迅速, 因此必須選擇合適的流速, 保證試劑能
夠充分混合并能獲得較高的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。流速太快
樣品來不及混合反應(yīng), 不能有效地采集反應(yīng)信號(hào), 并
且流路壓力過大, 易造成管路泄露; 流速太慢不易形
成連續(xù)的流體。
本研究考察了0.20~0.45 mL/min 的流速情況下
的發(fā)光趨勢(shì), 如圖5 所示: 隨著流速的增大, 相對(duì)化
學(xué)發(fā)光強(qiáng)度不斷增大, 基線達(dá)到平衡的時(shí)間逐漸延
長(zhǎng)。但是隨著流速的增加, 化學(xué)發(fā)光的值波動(dòng)較大,
泵壓也相應(yīng)增加。綜合考慮達(dá)到平衡所需時(shí)間, 以及
實(shí)驗(yàn)所需發(fā)光強(qiáng)度, 選擇流速為0.40 mL/min。
圖5 恒流泵流速對(duì)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)的的影響(n=3)
Fig. 5 The effect of constant-flow pump speed on relative
chemiluminescence intensity(n=3)
3.1.4 底物濃度的影響
底物硫代乙酰膽堿對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度影響很大。本
實(shí)驗(yàn)考察了0~100 mmol/L 濃度條件下底物對(duì)化學(xué)發(fā)
光強(qiáng)度的影響。結(jié)果如圖6 所示, 底物濃度在0~20
mmol/L 范圍內(nèi), 化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著底物濃度的增加而
急劇上升; 而當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?0 mmol/L 后, 吸光度積
分值趨于平緩。所以選擇底物最佳濃度為20 mmol/L。
圖6 底物濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度變化值的影響(n=3)
Fig. 6 The effect of substrate concentration on
chemiluminescence intensity(n=3)
3.1.5 底物與酶接觸時(shí)間的影響
在一定范圍內(nèi), 底物與酶作用的時(shí)間越長(zhǎng), 生
物傳感器顯示化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度變化越明顯。但由于有機(jī)
磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥是底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑, 將影
響農(nóng)藥對(duì)酶抑制程度的準(zhǔn)確性。
本實(shí)驗(yàn)研究了底物濃度為20 mmol/L 時(shí)與酶作
用20~120 s 時(shí)間范圍內(nèi)對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。從
圖7 所示, 作用時(shí)間在20~100 s 范圍內(nèi), 化學(xué)發(fā)光值
逐漸增強(qiáng), 當(dāng)超過70 s 后, 化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度變化緩慢,
并且化學(xué)發(fā)光積分值峰形變得鈍和寬, 出現(xiàn)拖尾現(xiàn)
象。所以選擇最佳的酶與底物的接觸時(shí)間為70 s 作
為后續(xù)的研究。
3.1.6 農(nóng)藥抑制時(shí)間的影響
乙酰膽堿酯酶與有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的
反應(yīng), 類似于酶與底物的反應(yīng)。首先二者形成酶-農(nóng)
藥復(fù)合物, 隨后農(nóng)藥的?；D(zhuǎn)移到酶活性中心絲氨
酸上的羥基使酶喪失活性, 從而使酶-受到抑制。農(nóng)
藥對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制時(shí)間不同, 生物傳感器的
響應(yīng)值變化也不同。
本研究選用1 μg/mL 的敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)溶液考察了
4168 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào) 第5 卷
5~30 min 抑制時(shí)間內(nèi), 生物傳感器響應(yīng)值的變化, 趨
勢(shì)圖如圖8 所示: 在5~20 min 時(shí)間范圍內(nèi), 隨著農(nóng)藥
與酶反應(yīng)器接觸時(shí)間的延長(zhǎng), 酶活受抑制的程度不
斷增強(qiáng), 當(dāng)抑制時(shí)間大于20 min 時(shí), 酶活抑制率雖
然還有上升趨勢(shì), 但是變化幅度較小。因此, 本研究
最終選擇20 min 作為農(nóng)藥抑制時(shí)間。
圖7 底物與酶接觸時(shí)間對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度變化值的影響(n=3)
Fig. 7 The effect of substrate contacting time on
chemiluminescence intensity (n=3)
圖8 農(nóng)藥抑制時(shí)間對(duì)酶活力的影響(n=3)
Fig. 8 The effect of inhibition time on inhibition rate(n=3)
3.1.7 恢復(fù)時(shí)間的影響
有報(bào)道[23]發(fā)現(xiàn)3 種肟類化合物對(duì)辛硫磷抑制乙
酰膽堿酯酶具有重活化作用。目前常用的重活化劑多
為肟類化合物, 如氯磷定、雙復(fù)磷、甲磺磷定、雙磷
定等。本研究區(qū)采用碘解磷定(2-PAM)作為乙酰膽堿
酯酶的復(fù)活劑, 選用1 μg/mL 的敵敵畏溶液作用酶反
應(yīng)器20 min 后, 研究1 mmol/L 2-PAM 對(duì)酶活恢復(fù)的
最佳時(shí)間。研究考察了5~30 min 恢復(fù)時(shí)間對(duì)傳感器
化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響, 結(jié)果如圖9 所示: 當(dāng)2-PAM溶
液的作用時(shí)間等于或大于15 min 時(shí), 受到抑制的固定
化酶的活力可以恢復(fù)到初始酶活的87%以上, 延長(zhǎng)恢
復(fù)時(shí)間可以更好地恢復(fù)酶活, 但綜合考慮檢測(cè)時(shí)間和
恢復(fù)率等因素, 確定恢復(fù)時(shí)間為15 min 比較合適。
圖9 恢復(fù)時(shí)間對(duì)酶活恢復(fù)率的影響(n=3)
Fig. 9 The effect of recovery time on recovery rate(n=3)
3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
分別配制濃度為0.1~10 μg/mL 的辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶
液, 濃度為0.08~10 μg/mL的敵敵畏標(biāo)準(zhǔn)溶液, 濃度為
0.8~15 μg/mL 的樂果標(biāo)準(zhǔn)溶液, 濃度為0.08~15 μg/mL
的克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液, 濃度為0.1~10 μg/mL 西維因標(biāo)準(zhǔn)
溶液, 濃度為0.1~10 μg/mL 的滅多威標(biāo)準(zhǔn)溶液。
在最佳條件下測(cè)定化學(xué)發(fā)光值, 取農(nóng)藥的對(duì)數(shù)
濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo), 酶活抑制率(%)為縱坐標(biāo), 做
線性回歸方程, 并計(jì)算線性相關(guān)系數(shù); 以酶活抑制率
為5%作為檢出限, 結(jié)果如表1 所示。
3.3 精密度實(shí)驗(yàn)
在最佳條件下對(duì)含有辛硫磷、敵敵畏、樂果、克
百威、西維因、滅多威的溶液分別測(cè)定6 次, 如表2
所示, 其RSD 均小于7%, 可見所研制的傳感器具有
較好的精密度。
3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
在沒有農(nóng)藥抑制的條件下, 向傳感器連續(xù)6 次流
動(dòng)注射底物ATCh (0.05 mmol/L, 40 s), 所得到的峰值
見圖10。由圖可知, 雖然傳感器的基線隨著注射次數(shù)
第12 期 王曉朋, 等: 化學(xué)發(fā)光生物傳感器法測(cè)定食品中有機(jī)磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留 4169
的增加而產(chǎn)生一定的漂移, 但是傳感器對(duì)底物的響
應(yīng)較好(RSD=7.75%, n=6), 表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。
3.5 酶柱保存穩(wěn)定性
將固定化酶保存在4 ℃, 含0.02% NaN3、濃度
為0.1 mol/L, pH=8.0 的磷酸鹽緩沖液中, 每10 d 測(cè)定
一次化學(xué)發(fā)光值, 持續(xù)兩個(gè)月, 結(jié)果見圖11。固定化
酶的活力在整個(gè)保存期內(nèi)(60 d)稍有下降, 與原酶活
相比, 2 個(gè)月內(nèi)僅降低了23%。
3.6 樣品檢測(cè)及添加回收率
取包菜、蘋果樣品各三份, 分為三組, 分別向包
菜樣品中添加不同量的辛硫磷標(biāo)品, 分別為加標(biāo)前
辛硫磷含量的80%、100%、120%; 向蘋果樣品中添
表1 農(nóng)藥的線性相關(guān)方程、相關(guān)系數(shù)與檢出限
Table 1 Regression equation, correlation coefficient and limit of detection of pesticides
種類 線性范圍(μg/mL) 線性方程 相關(guān)系數(shù)(R²) 檢出限(μg/mL)
辛硫磷 0.1~10 Y = 10.366X + 18.995 0.9923 0.047
敵敵畏 0.08~10 Y = 16.22X + 25.614 0.9903 0.054
樂果 0.8~15 Y = 7.2755X + 8.0116 0.9904 0.388
克百威 0.08~15 Y = 19.843X + 31.059 0.9926 0.049
西維因 0.1~10 Y = 16.22X + 25.614 0.9972 0.051
滅多威 0.1~10 Y = 12.001X + 18.182 0.9944 0.080
表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果
Table 2 The results of precision experiment
農(nóng)藥
檢測(cè)次數(shù)(μg/mL) RSD值(%)
1 2 3 4 5 6
辛硫磷 1.982 2.071 2.032 2.206 2.301 1.871 6.897
敵敵畏 1.117 1.172 1.093 1.106 1.038 1.002 5.539
樂果 2.212 2.082 2.193 1.926 2.036 2.124 4.628
克百威 1.024 1.041 1.074 1.176 1.137 1.021 5.435
西維因 1.087 1.106 1.171 1.038 0.965 1.026 6.577
滅多威 1.106 1.047 1.175 1.098 1.037 1.041 4.520
圖10 多次注射底物ATCh 后傳感器的響應(yīng)值
Fig. 10 Responses of the biosensor to repeated injection of ATCh
圖11 傳感器化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化(n=3)
Fig. 11 The stability of microfluidic biosensor(n=3)
4170 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào) 第5 卷
表3 農(nóng)藥在包菜、蘋果中的添加回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差
Table3 Pesticides recoveries and relative standard deviation in cabbage, apple
樣品 農(nóng)藥種類 加標(biāo)前量±SD 值 (μg/g) 加標(biāo)量 (μg/g) 期望值 (μg/g) 測(cè)量值±SD 值 (μg/g) 回收率±SD (n=3)
包菜 辛硫磷
1.297±0.04 1.000 2.297 2.194±0.101 0.900±0.084
1.297±0.04 1.300 2.597 2.477±0.104 0.909±0.083
1.297±0.04 1.560 2.857 2.743±0.115 0.929±0.072
蘋果 西維因
2.31±0.066 1.800 4.110 4.071±0.049 0.982±0.033
2.31±0.066 2.260 4.570 4.512±0.154 0.977±0.073
2.31±0.066 2.600 4.910 4.827±0.093 0.971±0.036
加不同量的西維因標(biāo)品, 分別為加標(biāo)前含量的80%、
100%、120%, 1 h 后按2.2.7 方法處理, 用所建立的生
物傳感器在最優(yōu)測(cè)定條件下進(jìn)行測(cè)定。選用辛硫磷標(biāo)
準(zhǔn)曲線對(duì)包菜中的辛硫磷含量與加標(biāo)回收率進(jìn)行計(jì)
算, 選用西維因標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)蘋果中的西維因含量與
加標(biāo)回收率進(jìn)行計(jì)算, 結(jié)果如表3 所示, 可以看出各
個(gè)樣品回收率均大于90%, 在90%~99%之間, 平均
偏差≤8.5%, 具有較好的回收率, 表明此方法對(duì)檢
測(cè)包菜、蘋果中的有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留檢
測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確。
4 結(jié) 論
本研究構(gòu)建了微流控芯片與固定化酶柱結(jié)合的
化學(xué)發(fā)光生物傳感器法測(cè)定有機(jī)磷與氨基甲酸酯農(nóng)
藥殘留的新方法。同時(shí)建立了辛硫磷、敵敵畏、樂果、
克百威、西維因、滅多威的標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)農(nóng)藥殘留濃
度在一定范圍內(nèi)時(shí), 化學(xué)發(fā)光值與農(nóng)藥對(duì)數(shù)濃度有
良好的線性關(guān)系(R²>0.99), 辛硫磷檢測(cè)范圍為
0.1~10 μg/mL, 檢出限為0.047 μg/mL; 敵敵畏檢測(cè)
范圍為0.08~10 μg/mL, 檢出限為0.054 μg/mL; 樂果
檢測(cè)范圍為0.8~15 μg/mL, 檢出限為0.388 μg/mL;
克百威檢測(cè)范圍為0.08~15 μg/mL, 檢出限為0.049
μg/mL; 西維因檢測(cè)范圍為0.1~10 μg/mL, 檢出限為
0.051 μg/mL; 滅多威檢測(cè)范圍為0.1~10 μg/mL, 檢
出限為0.080 μg/mL, 研究擴(kuò)大了檢測(cè)的線性范圍,
為農(nóng)藥殘留的檢測(cè)提供了一種新思路。
同時(shí), 本研究對(duì)傳感器的性能進(jìn)行了評(píng)價(jià), 測(cè)試
指標(biāo)有精密度、穩(wěn)定性、加標(biāo)回收率、酶柱保存活性
等。實(shí)驗(yàn)證明, 此生物傳感器有著良好的性能, 適用
于農(nóng)藥殘留的快速分析, 具有操作簡(jiǎn)單、效率高、工
作量小的特點(diǎn)。此外該方法檢出限小于我國(guó)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)
規(guī)定的蔬菜、水果中農(nóng)藥最高殘留限量(MRL)值(0.2
mg/kg 和0.5 mg/kg)的要求, 因此本法完全滿足對(duì)蔬
菜、水果中有機(jī)磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留的分析。
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(責(zé)任編輯: 楊翠娜)
作者簡(jiǎn)介
王曉朋, 本科, 主要研究方向?yàn)槭称?
科學(xué)與工程。
E-mail: 937530451@qq.com
劉曉宇, 博士, 教授, 博士生導(dǎo)師,
主要研究方向?yàn)槭称钒踩c農(nóng)業(yè)資源綜合
利用。

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