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化學發(fā)光免疫分析方法在食品安全檢測中的研究進展

文檔作者：金茂俊王靜楊麗華杜鵬飛邵華金芬王珊珊文檔來源：中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室		點擊數(shù)：	更新時間： 2025年06月06日
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上一篇：化學技術在食品安全檢測中的應用

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第5 卷 第3 期 食品安全質(zhì)量檢測學報 Vol. 5 No. 3
2014 年3 月 Journal of Food Safety and Quality Mar. , 2014
基金項目: 國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203094)、國家國際科技合作專項資助(2012DFA31140)、吉林省世行貸款農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全
項目(2011-Z50)
Fund: Supported by Public-interest industrial Science &amp;amp; Technology Project (201203094), International Science &amp;amp; Technology Cooperation
Program of China (2012DFA31140) and World Bank Loan Project in Jilin Provincial Agro-products Quality &amp;amp; Safety Project (2011-Z50)
*通訊作者: 王靜, 教授, 主要研究方向為食品安全檢測技術。E-mail: w_jing2001@126.com
*Corresponding author: WANG Jing, professor, Institute of Quality Standards &amp;amp; Testing Technology for Agro-Products, Chinese Academy of
Agricultural Sciences, No. 12, Southern Street of Zhongguancun, Haidian District, Beijing 100081, China. E-mail: w_jing2001@126.com
化學發(fā)光免疫分析方法在食品安全檢測中的
研究進展
金茂俊, 王 靜*, 楊麗華, 杜鵬飛, 邵 華, 金 芬, 王珊珊, 佘永新
(中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所, 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室, 北京 100081)
摘要: 化學發(fā)光免疫分析方法作為一項具有高特異性和高靈敏度的免疫分析方法, 經(jīng)過近幾十年的發(fā)展, 目前
已在食品安全檢測領域得到了良好的應用。本文根據(jù)不同化學發(fā)光免疫分析方法所選擇標記物的不同, 將化學發(fā)
光免疫分析方法分為化學發(fā)光免疫分析、化學發(fā)光酶免疫分析和電化學發(fā)光免疫分析三個類別, 并對各方法常用
的化學發(fā)光標記物及分析方法原理進行介紹。同時, 綜述了化學發(fā)光免疫分析方法在農(nóng)獸藥殘留、生物毒素、違
禁添加物及微生物檢測方面的應用進展情況。隨著化學發(fā)光免疫分析方法在新型化學發(fā)光標記物及化學發(fā)光增敏
體系方面取得進一步的研究進展, 其在食品安全檢測領域必將得到更為廣泛的應用。
關鍵詞: 化學發(fā)光免疫分析; 食品安全; 研究進展
Latest progress of chemiluminescent immunoassay in food safety detection
JIN Mao-Jun, WANG Jing*, YANG Li-Hua, DU Peng-Fei, SHAO Hua, JIN Fen,
WANG Shan-Shan, SHE Yong-Xin
(Key Laboratory for Agro-Products Quality and Safety of Ministry of Agriculture, Institute of Quality Standards &amp;amp; Testing
Technology for Agro-Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)
ABSTRACT: Chemiluminescent immunoassay (CLIA) as the technology with high specificity and sensitivity,
after decades of development, has got a good application in the field of food safety detection. According to the
different labelled substances used in the CLIA system, the methods were divided into CLIA, chemiluminescent
enzyme immunoassay (CLEIA) and electrochemiluminescent immunoassay (ECLIA). This review briefly described
the classical chemiluminescent labelled substances and the principles of various CLIA systems. Meanwhile,
the application of CLIA in the detection of pesticide residue, veterinary drug residue, biological toxins,
prohibited addictives, and microorganisms were introduced. Accompanied with the further development of
CLIA applied in novel chemiluminescent labelled substances and sensitized system, the technology will have a
prosperous future in detection of food safety.
KEY WORDS: chemiluminescent immunoassay; food safety; research progress
第3 期 金茂俊, 等: 化學發(fā)光免疫分析方法在食品安全檢測中的研究進展 841
化學發(fā)光是在常溫下由化學反應產(chǎn)生的光的發(fā)
射。其發(fā)光機理是: 反應體系中的某些物質(zhì)分子, 如
反應物、中間體或者熒光物質(zhì)吸收了反應釋放的能量
而由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài), 當中間體由激發(fā)態(tài)回到基
態(tài)時會, 釋放等能量的光子, 對光子進行測定而實現(xiàn)
定量分析[1]。化學發(fā)光免疫分析方法是將化學發(fā)光與
免疫分析相結合的方法, 具有靈敏度高、特異性強、
線性范圍寬、成本底、操作簡單、應用廣泛、檢測時
間短、易于實現(xiàn)自動化且無放射性污染等優(yōu)點[2], 已
在食品安全檢測領域得到越來越廣泛的應用。
1 化學發(fā)光免疫分析方法的類別
根據(jù)化學發(fā)光免疫分析體系中所選標記物的不
同, 將化學發(fā)光免疫分析方法分為化學發(fā)光免疫分
析、化學發(fā)光酶免疫分析及電化學發(fā)光免疫分析三
大類。
化學發(fā)光免疫分析是用化學發(fā)光標記物質(zhì)直接
標記抗體或抗原的一類免疫分析方法。作為化學發(fā)光
標記物, 目前使用最多的是魯米諾類和吖啶酯類這
兩類物質(zhì)。(1)魯米諾類物質(zhì)標記的化學發(fā)光為氧化
反應發(fā)光。在堿性環(huán)境中, 魯米諾可被許多物質(zhì)氧化
發(fā)光, 其中過氧化氫(H2O2)最為常用。為了提高化學
發(fā)光反應速率, 需向這一反應體系中添加某些酶類
或無機催化劑。催化用的酶類主要選擇辣根過氧化物
酶(HRP), 無機催化劑主要包括O3、鹵族元素及Fe3+、
Cu2+、Co2+和它們的配合物。(2)吖啶酯類物質(zhì)標記的
化學發(fā)光是在堿性環(huán)境中, 吖啶酯類物質(zhì)被H2O2 氧
化, 迅速產(chǎn)生光子, 具有很好的量子產(chǎn)率。將吖啶酯
類物質(zhì)作為化學發(fā)光免疫分析的化學發(fā)光標記物,
具有發(fā)光體系簡單、反應速率快、無需催化劑、標記
效率高、發(fā)光本底低等優(yōu)點。
化學發(fā)光酶免疫分析是用酶標記抗原或抗體的
一類化學發(fā)光免疫分析方法。酶標記抗原或者抗體進
行特異性免疫反應后, 免疫反應復合物上的酶催化
化學發(fā)光底物在信號試劑作用下發(fā)光。目前應用最為
廣泛的標記酶是HRP 和堿性磷酸酶(ALP), 這兩種酶
都有各自的發(fā)光底物。HRP 最常用的發(fā)光底物是魯
米諾及其衍生物。在化學發(fā)光酶免疫分析中, 使用
HRP 標記抗體或抗原, 免疫反應后, 將魯米諾作為
發(fā)光底物, 在堿性環(huán)境及HRP 存在下, 魯米諾被
H2O2 氧化發(fā)光, HRP 的濃度決定了化學發(fā)光的強度。
這一傳統(tǒng)的化學發(fā)光體系(HRP- H2O2-魯米諾)為持
續(xù)幾秒的閃光型發(fā)光, 存在發(fā)光強度低、不易測量等
缺點。在這一化學發(fā)光反應體系中加入化學發(fā)光增強
劑, 可大大增強發(fā)光信號, 并在較長的時間內(nèi)保持發(fā)
光穩(wěn)定, 從而提高這一化學發(fā)光反應體系的分析靈
敏度和準確性。ALP 最常用的發(fā)光底物是1,2-二氧環(huán)
已烷類物質(zhì)。這類化學發(fā)光體系中最為經(jīng)典的是
Bronstein 等提出的3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-
磷氧酰)-苯基-1,2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽(AMPPD)-ALP
發(fā)光體系。這一化學發(fā)光反應體系的特點是反應速度
快, 短時間可提供檢測結果。
電化學發(fā)光免疫分析是將電化學發(fā)光與免疫分
析相結合的一類化學發(fā)光免疫分析方法。電化學發(fā)光
是一種在電極表面由電化學引發(fā)的特異性化學發(fā)光
反應。電化學發(fā)光與化學發(fā)光的差異在于電化學發(fā)光
是電啟動發(fā)光反應, 而化學發(fā)光是通過化合物混合
起動發(fā)光反應, 因此電化學發(fā)光反應易精確控制。電
化學發(fā)光免疫分析最常用的發(fā)光底物是三聯(lián)吡啶釕
[Ru(byp)3
2+], 三丙胺(TPA)用來激發(fā)這個體系的發(fā)光
反應。在陽極表面, Ru(byp)3
2+ 和TPA 同時失去電子,
Ru(byp)3
2+被氧化成Ru(byp)3
3+, TPA 被氧化成陽離子
自由基(TPA+ *), TPA+ *將自發(fā)地釋放一個質(zhì)子而變
成非穩(wěn)定分子(TPA*), 并將一個電子傳遞給
Ru(byp)3
3+, 形成激發(fā)態(tài)的Ru(byp)3
2+ *, Ru(byp)3
2+ *在
衰減的同時發(fā)射一個波長為620 nm 的光子, 重新回
到基態(tài)Ru(byp)3
2+。這一反應過程在電極表面反復進
行, 從而產(chǎn)生高效、穩(wěn)定的連續(xù)發(fā)光, 發(fā)光強度不斷
增強。
2 化學發(fā)光免疫分析方法在食品安全檢測
中的應用
1977 年, Halman 等[3]首先將化學發(fā)光與免疫分
析方法相結合, 建立了化學發(fā)光免疫分析方法, 實現(xiàn)
了對微生物的檢測。自此以后, 化學發(fā)光免疫分析方
法在醫(yī)學檢測領域被大量成功應用[4-10]。近年來, 化
學發(fā)光免疫分析方法受到食品安全研究領域科研人
員的極大關注, 實現(xiàn)了其對農(nóng)獸藥殘留、生物毒素、
違禁添加物和微生物的高靈敏度檢測。
2.1 在農(nóng)獸藥殘留檢測中的應用
在農(nóng)藥殘留檢測方面, Schlaeppi 等[11]將化學發(fā)
光免疫分析方法應用于農(nóng)藥殘留檢測, 利用磁性物
質(zhì)與化學發(fā)光免疫分析方法相結合, 實現(xiàn)了醚苯磺
842 食品安全質(zhì)量檢測學報 第5 卷
隆的快速檢測, 其在水樣中的檢測限為0.02 ng/mL,
并將建立的化學發(fā)光免疫分析方法與液相色譜法進
行了比較研究, 結果顯示其有著較好的相關性(R2=
0.96)。1999 年, Samsonova 等[12]基于三氮苯類除草劑
的混合抗體, 建立了阿特拉津、草凈津和莠滅凈等三
種除草劑的多殘留免疫分析方法, 方法回收率為
70%~100%。2003 年, Alexandra 等[13]基于酶聯(lián)免疫和
化學發(fā)光酶免疫法, 分別建立了DDT 及其代謝物的
兩種免疫分析方法, 并對食物樣品中的DDT 及其代
謝物進行檢測。結果顯示: 建立的酶聯(lián)免疫法IC50
值為0.6 ng/mL, 而化學發(fā)光酶免疫法的IC50 值為0.2
ng/mL。Barbora 等[14]基于化學發(fā)光酶免疫分析, 建立
了氨基甲酸酯類農(nóng)藥的化學發(fā)光免疫分析方法, 實
現(xiàn)對克百威、甲萘威和滅蟲威的檢測, 三種物質(zhì)的檢
測限分別為0.03 ng/mL、0.007 ng/mL 和0.004 ng/mL。
2012 年, 王靜等[15]研究建立了三唑磷農(nóng)藥的化學發(fā)
光酶免疫分析方法, 該方法的線性檢測范圍為
0.04~5 ng/mL, 最低檢測限為0.063 ng/mL, 對生菜、
胡蘿卜、蘋果、水和土壤的添加回收率分別為
78.71%、67.52%、118.3%、117.2% 和122.0%。
在獸藥殘留檢測方面, Lin 等[16]基于化學發(fā)光免
疫分析方法, 實現(xiàn)了對食品中氯霉素的檢測, 其方法
靈敏度為0.05 ng/mL, 且方法的精密度、特異性及準
確度等指標均與酶聯(lián)免疫分析方法相當, 十個樣品
的板內(nèi)和板間變異系數(shù)分別小于8%和20%, 樣品的
添加回收率87%~100%。Wutz 等[17]基于化學發(fā)光免
疫分析方法, 建立了蜂蜜中恩諾沙星、磺胺二甲基
嘧啶、磺胺嘧啶和鏈霉素的多殘留檢測方法。Tao
等[18]基于化學發(fā)光酶免疫分析, 建立了氟苯尼考
及其代謝產(chǎn)物氟苯尼考胺的免疫分析方法, 雞肉
中氟苯尼考的檢測限為0.526 ng/mL, 添加回收率
為71.8%~102%, 氟苯尼考胺的檢測限為0.453
ng/mL, 添加回收率為70.3%~100%。2013 年, Tao
等[19]通過將氯霉素和氟苯尼考的抗體相混合, 建
立了可同時檢測火腿腸中氯霉素、氟苯尼考及其代
謝物氟苯尼考胺的化學發(fā)光酶免疫分析方法, 該方
法氯霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的檢測限分別為
0.01、2.8、3.0 μg/kg。
因目前國際食品法典委員會及我國主要貿(mào)易國
對農(nóng)獸藥殘留的最大殘留限量值(MRL)標準的制定
日趨嚴格, 且農(nóng)畜產(chǎn)品中可能存在的農(nóng)獸藥多殘留
現(xiàn)象, 使得化學發(fā)光免疫分析方法在農(nóng)獸藥殘留檢
測方面朝著高靈敏度和多殘留檢測方向發(fā)展。因化
學發(fā)光免疫分析方法本身存在高靈敏的優(yōu)點, 該方
法在農(nóng)獸藥殘留檢測方面的研究將會進一步拓展和
深化。
2.2 在生物毒素檢測中的應用
Quan 等[20]基于化學發(fā)光酶免疫分析, 建立了食
品中伏馬菌素B1 的免疫分析方法, 該方法的線性范
圍為0.14~0.9 μg/L, 方法的靈敏度(以IC50 衡量)為
0.32 μg/L, 方法的最低檢測限(以IC10 衡量)為0.09
μg/L, 與建立的伏馬菌素B1 酶聯(lián)免疫分析方法相比,
其方法檢測靈敏度提高10 倍, 且回收率滿足相關要
求。Magliulo 等[21]基于化學發(fā)光酶免疫分析, 建立了
牛奶中黃曲霉毒素M1 的免疫分析方法。通過將黃曲
霉毒素M1-牛血清白蛋白(BSA)的偶聯(lián)物包被在聚丙
烯固相載體上, 加入黃曲霉毒素M1 抗體和待測樣品,
競爭反應后, 加入酶標二抗, 實現(xiàn)對黃曲霉毒素M1
的定量檢測。針對牛奶樣品, 該方法的最低檢測限1
pg/mL, 批內(nèi)批間的變異系數(shù)均小于9%, 添加回收
率在96%~122%之間。Wang 等[22]基于生物素-親和素
及膠體金的放大作用, 建立了食品中玉米雌霉烯酮
的化學發(fā)光免疫分析方法, 該方法的檢測限為0.008
ng/mL, 線性范圍為0.02~0.51 ng/mL, 添加回收率在
97%~117%之間。
Yang 等[23]基于碳納米管技術, 建立了牛奶、蘋
果汁和嬰兒食品中葡萄球菌腸毒素B(SEB)的化學發(fā)
光免疫分析方法, 通過將SEB 抗體包被在碳納米管
表面, 進一步將包被有SEB 抗體的碳納米管固定在
聚碳酸酯表面, 最后通過增強化學發(fā)光免疫分析方
法測定SEB 含量。在牛奶、蘋果汁和嬰兒食品中, 該
方法的最低檢測限為0.01 ng/mL, 相比于酶聯(lián)免疫分
析方法, 其最低檢測限提高了100 倍。Kijek 等[24]基
于磁性納米和電化學發(fā)光免疫分析方法, 實現(xiàn)了對
食品中葡萄球菌腸毒素B 的檢測。該方法的檢測靈
敏度為1 pg/mL, 線性范圍為0.1~100 ng/mL。Zhang
等[25]基于化學發(fā)光酶免疫分析, 建立了水、橙汁、牛
肉、火腿及牛奶中葡萄球菌腸毒素A 的免疫分析方
法, 該方法具有很高的檢測靈敏度, 其線性檢測范圍
為6.4~1600 pg/mL, 最低檢出限為3.2 pg/mL。
化學發(fā)光免疫分析方法在伏馬菌素、黃曲霉毒
素、玉米雌霉烯酮、葡萄球菌腸毒素已得到了較好的
應用, 且具有很好的檢測靈敏度, 但仍需開展化學發(fā)
第3 期 金茂俊, 等: 化學發(fā)光免疫分析方法在食品安全檢測中的研究進展 843
光免疫分析體系研究, 進一步提高化學發(fā)光免疫分
析方法的穩(wěn)定性, 更好實現(xiàn)化學發(fā)光免疫分析方法
在生物毒素檢測方面的應用。
2.3 在違禁添加物檢測中的應用
Roda 等[26]基于化學發(fā)光酶免疫分析, 建立了克
倫特羅的免疫分析方法, 該方法的檢測限為0.08
ng/mL, 變異系數(shù)小于10%, 添加回收率在
96%~110%之間。Pou 等[27]基于化學發(fā)光酶免疫分析,
建立了沙丁胺醇和克倫特羅的免疫分析方法, 實現(xiàn)
了對豬肝、豬腎及豬肉中兩種物質(zhì)的檢測。Han 等[28]
基于時間分辨化學發(fā)光技術, 建立了豬尿中克倫特
羅和萊克多巴胺的化學發(fā)光免疫分析方法, 所建立
的方法線性檢測范圍為1.0~500 ng/mL, 檢測限
(S/N=2)為0.50 ng/mL。
Choi 等[29]基于化學發(fā)光酶免疫分析, 建立了牛
奶中三聚氰胺的免疫分析方法。因牛奶中脂肪會干擾
三聚氰胺及三聚氰胺抗體的免疫反應, 該方法在化
學發(fā)光反應體系添加草?；溥? 以降低脂肪對
免疫反應的干擾。該方法的檢測限為6.3 ng/mL, 線
性范圍為62.5~2000 ng/mL。
目前建立的克倫特羅、萊克多巴胺及三聚氰胺的
化學發(fā)光免疫分析方法, 方法檢測限均低于10
ng/mL, 具有很高的檢測靈敏度, 可有效滿足農(nóng)產(chǎn)品
質(zhì)量安全監(jiān)管的需求, 隨著將化學發(fā)光免疫分析方
法應用于更多違禁添加物的檢測, 將可更加體現(xiàn)該
方法的應用價值。
2.4 在微生物檢測中的應用
楊秀岑等[30]基于化學發(fā)光酶免疫分析, 建立了
食品中沙門氏菌的免疫分析方法。該方法先將沙門氏
菌固定在聚氯乙烯固相載體上, 再與沙門氏菌抗體
溫育1 h, 加入HRP 標記二抗, 利用間接化學發(fā)光免
疫法實現(xiàn)對食品中沙門氏菌的快速檢測。經(jīng)對62 份
食品樣品進行檢測, 將P/N≥3 作為陽性判定標準,
結果符合率達到85.5%。
郭小英等[31]基于化學發(fā)光酶免疫分析, 建立了
食品中O157:H7 大腸埃希菌的免疫分析方法。該方
法利用AMPPD-ALP 化學發(fā)光反應體系, 通過磁珠
酶聯(lián)免疫分析法對O157:H7 大腸埃希菌進行檢測。
方法檢測靈敏度達850 CFU/mL, 線性范圍為
1000~50000 CFU/mL, 批間變異系數(shù)小于15%, 批內(nèi)
變異系數(shù)小于20%, 與人工計數(shù)培養(yǎng)檢測結果相比
其相關系數(shù)達0.98。Shelton 等[32]基于電化學發(fā)光免
疫分析方法, 建立了水中大腸桿菌的檢測方法, 該方
法的最低檢出限為1000 CFU/mL, 線性范圍在
1000~10000 CFU/mL 之間。
基于化學發(fā)光免疫分析方法, 實現(xiàn)了對食品中
沙門氏菌、大腸桿菌的檢測, 檢測結果與人工計數(shù)培
養(yǎng)相比有著較高的準確度, 檢測靈敏度高, 并可大大
節(jié)約檢測時間, 基于此, 化學發(fā)光免疫分析方法將是
微生物檢測很有前途的發(fā)展方向。
3 化學發(fā)光免疫分析方法的發(fā)展方向
化學發(fā)光免疫分析方法作為一種具有良好發(fā)展
前景的技術, 已在食品安全檢測領域得到了較好的
應用。整體而言, 化學發(fā)光免疫分析方法相對于傳統(tǒng)
的酶聯(lián)免疫分析方法有著較高的靈敏度, 但其方法
的批內(nèi)批間變異系數(shù)會高于酶聯(lián)免疫分析方法。其原
因主要是現(xiàn)有的化學發(fā)光標記物在發(fā)光達到頂峰衰
減后, 其發(fā)光值尚不十分穩(wěn)定。因此, 化學發(fā)光免疫
分析方法仍需在以下幾方面開展研究。1)繼續(xù)篩選新
的化學發(fā)光標記物; 2)在現(xiàn)有化學發(fā)光反應體系中,
開展化學發(fā)光增敏體系研究; 3)加強電化學發(fā)光免疫
分析方法在食品安全檢測領域的應用研究?？梢灶A計,
隨著科學家們更多的關注于解決化學發(fā)光標記物發(fā)
光穩(wěn)定性問題, 化學發(fā)光免疫分析方法在食品安全
領域?qū)⒌玫礁鼮閺V泛全面的應用。
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(責任編輯:鄧偉)
作者簡介
金茂俊, 副研究員, 博士, 主要研究
方向為食品安全快速檢測技術。
E-mail: katonking@163.com
王靜, 教授, 博士, 主要研究方向為
食品安全檢測技術。
E-mail: w_jing2001@126.com

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