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ATP生物發(fā)光法評價餐飲具的微生物污染研究

文檔作者：張鳳蘭，徐瀟，王海燕，高飛單純，崔生輝文檔來源：中國食品藥品檢定研究院		點擊數(shù)：	更新時間： 2025年06月08日
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上一篇： HACCP體系在校園餐飲安全中的應(yīng)用

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第7卷第3期
2016年3月
食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報、，01．7 NO．3
Journal ofFood Salty and Quality Mar,，2016
ATP生物發(fā)光法評價餐飲具的微生物污染研究
張鳳蘭，徐瀟，王海燕，高飛，單純，崔生輝+
(中國食品藥品檢定研究院，北京100050)
摘要：目的對ATP生物發(fā)光法與平板計數(shù)法在評價餐飲具微生物污染的檢出限及檢出率進行評價，并對2
種方法的相關(guān)性進行研究。方法應(yīng)用3家國內(nèi)公司生產(chǎn)的ATP生物發(fā)光檢測儀，分別對不同濃度的ATP標(biāo)
準(zhǔn)溶液檢測并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以不同濃度的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌液及人工接種大腸桿菌的餐飲具作為
被檢品，分別應(yīng)用ATP生物發(fā)光法和平板計數(shù)法進行檢測，繪制ATP生物發(fā)光法對大腸桿菌、金黃色葡萄球
菌檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對2種檢測方法在人工污染餐飲具檢測的相關(guān)性繪制曲線。結(jié)果3家公司的ATP生物
發(fā)光檢測儀對ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的檢出限差異較大；但在某一檢測范圍內(nèi)，3家公司ATP
生物發(fā)光檢測儀的檢測RLU值與ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌量均有良好的線性相關(guān)性。3家公
司ATP生物發(fā)光檢測儀對人工接種大腸桿菌餐飲具的檢測顯示，ATP生物發(fā)光法與平板計數(shù)法有良好的線性相關(guān)
性。結(jié)論3家公司的ATP生物發(fā)光法對ATP、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的檢出限存在不同檢測儀的儀器誤
差，且差異較大，目前，ATP生物發(fā)光法不能替代傳統(tǒng)的平板計數(shù)法來評價餐飲具的微生物污染狀況。
關(guān)鍵詞：ATP生物發(fā)光法；平板計數(shù)法：餐飲具；微生物
Evaluation of microorganism on tableware by ATP bioluminescence
ZHANG Feng—Lan，XU Xiao，WANG Hai．Yan，GAO Fei，SHAN Chun，CUI Sheng—Hui+
(National Institutionsfo，F(xiàn)ood and Drug Control，Beoing 1 00050，China)
ABSTRACT：Objeetive To evaluate the detection 1imit and detection rate of the ATP bioluminescent
method and the plate count method for tableware microbial contamination．a(chǎn)nd investi譬ate the correlation
be觚een the 2 methods．Methods The standard solution with different concentrations were detected by the
different ATP bioluminescent detectors produced by domestic companies(A，B，and C，respectively)and the
standard curve was drawn after detection．Using different concentrations of Escherichia coli,Staphylococcus
aureus bacteria liquid and artificial inoculation of E．coli tableware as goods．the ATP bioluminescence detector
and the plate count method were used to detect them respectively，and then the standard curve of detection
value between the 2 methods for quantity of Escherichia coli，slaphylococcus aureus and tableware in artificial
pollution and the correlation curve were drawn between the 2 methods．Results The detection limit of ATP
standard solution．Escherichia coli and Staphy’lococcus aureus were different among the 3 kinds of ATP
bioluminescence detectors from different companies；but while in a detection range．the 3 kinds of different
ATP bioluminescence detectors had a good linear correlation．And the 2 different methods have a good 1inear
correlation．Conclusion There is an obvious instrument error between the difierent detectors from 3
companies on the detection limit for Escherichia coli and Staphylococcus aureus．And the difierence iS obvious．
+通訊作者：崔生輝，博士，研究員，主要研究方向為食品微生物。E-mail：cuishenghui@aliyun．tom
+CorrespoⅡdiⅡg author：CUI Sheng-Hui，Professor，National Institutions for Food and Drug Control，No．2 Tiantan Xili，Beijing 100050，China．
E—mail：cuishenghui@aliyun．corn
萬方數(shù)據(jù)
912 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報第7卷
therefore，the ATP bioluminescent method cannot replace the traditional plate count method for evaluating the
microbial contamination condition of tableware at present．
KEY WORDS：ATP bioluminescence；plate counting；tableware；microorganism
1 引言
餐飲具潔凈度檢測是監(jiān)控餐飲食品污染的一道
重要程序，《食品安全法》中要求餐飲具在使用前應(yīng)
當(dāng)徹底洗凈并消毒?。餐飲具的污染主要來自微生
物、食物殘渣或油脂等，微生物污染一直是餐飲具潔
凈度監(jiān)控中的首要目標(biāo)群。傳統(tǒng)的平板計數(shù)法是檢測
微生物污染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但因其檢測周期長，不能進
行實時監(jiān)控，在監(jiān)管工作中受到了限制。目前，ATP
生物發(fā)光法作為一種快速檢測方法，已初步用于食
品生產(chǎn)過程、廚房、冰箱、鐵路站車食品器具及餐飲
具等處的清潔度檢測[2。6】。
ATP(adenosine triphosphate)即三磷酸腺苷，是微
生物能量的主要載體，存在于所有動植物細胞中。
ATP生物發(fā)光法的基本原理就是通過裂解破壞細胞
壁將ATP釋放出來，在M92+存在時，ATP在熒光素酶
和D．熒光素的作用下，使ATP釋放磷酸基團并同時
發(fā)出熒光，然后通過檢測相對熒光強度(relative light
unit，RED)推算餐(飲)具被細菌、食物殘渣等污染的程
度。反應(yīng)式如下所示。D．劉笛蓁+御嶺等oXy_黼A舢Pi+H20
Omidbakhsh等[J7】曾對國外4個不同品牌的ATP
生物發(fā)光檢測儀的靈敏度進行對比研究，發(fā)現(xiàn)不同
品牌的儀器間的靈敏度存在較大差異。本研究首次對
我國不同品牌的3款A(yù)TP生物發(fā)光檢測儀，對ATP
標(biāo)準(zhǔn)溶液、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的檢出限進行
評價，并在餐飲具表面細菌的檢出效率方面與傳統(tǒng)
的平板計數(shù)法[B1進行相關(guān)性研究，以確定ATP生物發(fā)
光法是否能夠替代傳統(tǒng)的平板計數(shù)法來評價餐飲具
表面的微生物污染狀況。
2材料與方法
2．1菌株與試劑
標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌(ATCC29213)和大腸
桿菌(ATCC25922)(美國菌種保藏中心ATCC)。三磷
酸腺苷二鈉(ATE美國Sigma公司1。
2．2儀器與設(shè)備
ATP生物發(fā)光檢測儀(含有本公司配套的擦拭
子)：A、B、C公司為我國國產(chǎn)公司，A和B公司生產(chǎn)
手持式ATP生物發(fā)光檢測儀，C公司為便攜式ATP生
物發(fā)光檢測系統(tǒng)；培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；離心
機(美國Thermo公司)。
2．3實驗方法
2．3．1 ATP生物發(fā)光檢測儀的ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線建立
用高壓滅菌的去離子水配制濃度為10。2mol／L的
ATP溶液，并用去離子水按照1：10、1：100進行倍比
稀釋。從濃度為10。4、10‘1 3一?．和10’5mol／L的ATP
溶液中各取10 pL(A和B公司)或50 txL(C公司)JJHA
到拭子上，應(yīng)用生物發(fā)光檢測儀測定其RLU值
∽=3)。溶劑(去離子水)作為空白對照組。以ATP含
量的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以生物發(fā)光檢測儀的測量值
RLU的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2．3．2 ATP生物發(fā)光檢測儀的細菌量標(biāo)準(zhǔn)曲線建立
將新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌(ATCC25922)和金黃色
葡萄球菌(ATCC29213)接種于無菌的胰蛋白胨大豆
肉湯培養(yǎng)基(TSB)，37℃培養(yǎng)20 h后，3000 r／min離
心10 min，棄上清：用無菌0．85％的生理鹽水重懸沉
淀，3000 r／min離心1 0 min，棄上清，重復(fù)上述操作一
次。最后，用0．85％的無菌生理鹽水重懸沉淀，并對
菌液濃度進行調(diào)節(jié)，使其100倍稀釋菌液濁度為1．0
MCF，而后用0．85％的生理鹽水按1：10、1：102、1：103、
1：104、1：105進行倍比稀釋。
按照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789．2—2010【8】方法
檢測上述菌液濃度，同時操作空白對照組(0．85％的
無菌生理鹽水)。取不同濃度的菌液各10 IxL(A和B
公司)或50 I．tL(C公司)加入到ATP生物發(fā)光檢測儀的
擦拭子上，測其RLU值仞=3)。同時操作空白對照組
(0．85％的無菌生理鹽水)。
以細菌數(shù)量(CFU)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以ATP測
量值RLU的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2．3．3 餐(飲)具人工污染樣品的檢測
取洗凈的瓷盤120個，在瓷盤中央畫出4個5 cm
x5 cm的正方形，每兩個正方形之間彼此隔開。160cC
萬方數(shù)據(jù)
第3期張鳳蘭，等：ATP生物發(fā)光法評價餐飲具的微生物污染研究913
烘烤4 h滅菌備用。
將120個瓷盤分5組進行染菌，每組染菌24個
瓷盤：包括用不同濃度菌懸液(5個濃度，每個濃度染
4個瓷盤)染菌及4個空白對照(0．85％的生理鹽水)瓷
盤。具體染菌方式如下：將2．3．2中1：10、1：102、1：103、
1：104、1：105稀釋的大腸桿菌(ATCC25922)菌懸液各
取20皿，緩慢均勻加入到每個瓷盤的25 cm2正方形
中間，每個瓷盤的4個正方形均染相同濃度的大腸桿
菌。而后將這24個瓷盤進行盲法編號備用。
取盲法編號的染菌瓷盤，用棉簽蘸取o．85％的
生理鹽水，從每個瓷盤上的其中一個25 cm2正方
形方格中涂抹回收細菌，按食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB
4789．2．2010方法檢測細菌數(shù)量。在讀取菌落總數(shù)
結(jié)果時，為方便結(jié)果的對數(shù)轉(zhuǎn)換統(tǒng)計，如果平板上
未見菌落生長，則該平板菌落數(shù)記為1 CFU。分別
用3個公司的ATP生物發(fā)光檢測儀對編號的染菌
瓷盤中每個25 cm2正方形中的大腸桿菌進行快速
檢測。
按照樣品編號，以細菌數(shù)量(CFU)的對數(shù)值為橫
坐標(biāo)，以ATP測量值RLU的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，做劑
量反應(yīng)曲線。
3結(jié)果與分析
3．1 ATP生物發(fā)光法的標(biāo)準(zhǔn)曲線
A、B和C公司的ATP生物發(fā)光檢測儀對ATP
標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢出限分別為：1、10、0．5 fmol(1
fmol=10J5m01)(表1)，在10‘14mol與104mol濃度問，
ATP含量的對數(shù)值與RLU的對數(shù)值間均有良好的線
性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)都在0．95以上。見圖1。
41．A公司-B公司▲C公司
圖I ATP生物發(fā)光法的標(biāo)準(zhǔn)曲線
Fig．1 Standard curve ofATP bioluminescence
3．2 ATP生物發(fā)光方法與大腸桿菌量的標(biāo)準(zhǔn)曲線
A、B和C公司的ATP生物發(fā)光檢測儀對大腸
桿菌的檢出限分別為：1．47x104、1．47x103、7．35×101
CFU(表1)。大腸桿菌含量在1．47x104CFU與1．47x108
CFU間，3家公司的ATP生物發(fā)光檢測儀的RLU對
數(shù)值與細菌量對數(shù)值間均有良好的線性關(guān)系，線性
相關(guān)系數(shù)均在0．94以上。見圖2。
0 l 2 3 4 5 6 7 8 9 10
大腸桿菌量對數(shù)值(Log(CFU))
圖2 ATP生物發(fā)光方法與大腸桿菌量的標(biāo)準(zhǔn)曲線
Fig．2 Standard curve ofATP bioluminescence and the
amount ofE coli
3．3 ATP生物發(fā)光方法與金黃色葡萄球菌量
的標(biāo)準(zhǔn)曲線
A、B和C公司的ATP生物發(fā)光檢測儀對金黃
色葡萄球菌的檢出限分別為：1．55x105、I．55x104、
7．75x101 CFU(表1)。金黃色葡萄球菌含量在1．55x105
CFU與1．55×108CFU間，3家公司的ATP生物發(fā)光檢
測儀的RLU對數(shù)值與細菌量對數(shù)值間均有良好的線
性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均在0．98以上。見圖3。
0
3
宙
茍
3
道
巔
翟
邋
掣
劃
靛
暈
金黃色葡萄球菌量對數(shù)值(Log(CFU))
圖3 ATP生物發(fā)光方法與金黃色葡萄球菌量的標(biāo)準(zhǔn)曲線
Fig．3 Standard curve of A=rP bioluminescence and the
amount ofS aureus
9
8
7
6
5
4
3
一3邑s01)靼蒜安靼裝《霞霹 2●O
7
6
5
4
3
一3一邑暑01)靼輟螢迥裝越莨罌 2●n
萬方數(shù)據(jù)
914 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報第7卷
表1 ATP生物發(fā)光檢測儀對ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的檢出限
Table 1 The detection limit ofATP standard solution．E．coli and s．a(chǎn)ureus by ATP meter
3．4 ATP生物發(fā)光法與平板計數(shù)法的相關(guān)性
對人工污染不同濃度大腸桿菌的瓷盤進行檢測，
接種最低濃度大腸桿菌的瓷盤表面按食品安全國家
標(biāo)準(zhǔn)GB 4789．2．2010方法回收的菌量為2．95x102
CFU，接種最高濃度大腸桿菌的回收菌量為1．Oxl05
CFU。B公司和C公司的ATP生物發(fā)光儀均能檢測
到瓷盤上最低濃度組的2．95x 102 CFU大腸桿菌：而
A公司的ATP生物發(fā)光儀不能檢測到瓷盤上的
2．95x102 CFU大腸桿菌，能檢測較高濃度組瓷盤上
的1．55x103 CFU大腸桿菌。在平板計數(shù)法回收的大
腸桿菌2．95x102CFU與1．0×105CFU濃度間，用3家
公司的ATP生物發(fā)光檢測儀所得的RLU對數(shù)值與用
平板計數(shù)法對大腸桿菌計數(shù)的對數(shù)值間均有良好的
線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均在o．93以上。見圖4。
疊
3
蠱
茍三
趔
籟
靛
趔
架
劃
霞
罌
◆A公司一B公司▲C公司
圖4 ATP生物發(fā)光法與平板計數(shù)法的線性相關(guān)圖
Fig．4 Linear correlation ofATP bioluminescence method
and plate counting method
4結(jié)論與討論
本研究中，從我國市場上抽取的3家國產(chǎn)公司的
ATP生物發(fā)光檢測儀的結(jié)構(gòu)和功能都存在差異。A公
司和B公司的ATP生物發(fā)光檢測儀均為手持式，輕
巧便攜，拭子插入反應(yīng)液中，很快就能讀數(shù)，最大讀
數(shù)均為9999；C公司為ATP生物發(fā)光檢測系統(tǒng)，攜帶
不便，需逐步加入反應(yīng)試劑，讀數(shù)較慢，最大讀數(shù)為
106，最低檢測體積為50 pL，而不是10此。A、B、
C公司檢測儀對ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢出限均低于10
fmol，在10 fmol與106 fmol濃度間，ATP含量的對數(shù)
值與RLU對數(shù)值間的線性相關(guān)系數(shù)均在0．95以上，
與文獻報道的研究結(jié)果一致19,101。
A、B、C公司檢測儀對大腸桿菌的檢出限均低
于金黃色葡萄球菌，其中c公司的檢測儀靈敏度最
好，比B和C公司的低2—3個Log。但在檢測范圍內(nèi)，
ATP的檢測值與細菌量間均有良好的線性相關(guān)性。
Omidbakhsh等[_7】曾對國外4個不同品牌的ATP生物
發(fā)光檢測儀的靈敏度進行對比研究，對金黃色葡萄
球菌的檢出限也相差3個Log。這可能與不同公司使
用的擦拭子、ATP提取劑、M92+濃度、熒光素酶活
性等存在差異有關(guān)，對細菌ATP提取效果不同，ATP
反應(yīng)的條件存在差異，導(dǎo)致不同儀器的靈敏度存在
差別【ll-15]。
Turnertl0J用Charm Sciences公司生產(chǎn)的
novaLUM生物發(fā)光檢測儀對金黃色葡萄球菌的檢出
限為102 CFU，但Omidbaldash等[7】應(yīng)用Charm
Sciences公司對金黃色葡萄球菌的檢出限為105
CFU。同一家公司的檢測儀對金黃色葡萄球菌的檢出
限存在差異可能與細菌處于不同的生長狀態(tài)有關(guān)，
Turner等檢測的是對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌，此
時細菌細胞中的ATP含量較高，而Omidbakhsh等檢
測的是處于靜止期的金黃色葡萄球菌，此時細胞分
裂后消耗ATP,細菌細胞內(nèi)的ATP含量較少。本研究
檢測的也是生長處于靜止期的大腸桿菌和金黃色葡
萄球菌，檢出限較高。
為評價生物發(fā)光檢測儀是否能夠?qū)嶋H反映餐飲
具微生物污染的狀況，本研究在瓷盤上人工污染大
腸桿菌，分別應(yīng)用3家公司的儀器與平板計數(shù)法同時
進行檢測。結(jié)果顯示，2家公司的ATP生物發(fā)光檢測
萬方數(shù)據(jù)
第3期張鳳蘭，等：ATP生物發(fā)光法評價餐飲具的微生物污染研究915
儀均能檢測到2．95x 102 CFU的大腸桿菌，1家公司
能檢測到1．55x103 CFU大腸桿菌，3家公司的檢測
值與平板計數(shù)法的線性相關(guān)系數(shù)均高于0．93。文獻
報道，在我國曾利用ATP生物發(fā)光儀對餐飲具進
行過檢測，與傳統(tǒng)平板計數(shù)法的檢驗結(jié)果差異無
統(tǒng)計學(xué)意義?61。
但在實際檢測餐飲具時，微生物可能會處于“饑
餓狀態(tài)”，被命名為“VBNC(viable but not culturable)”．
此時，僅有l(wèi)／100的細菌能夠培養(yǎng)，并且細菌細胞內(nèi)
所含ATP的量較少，此時，ATP生物發(fā)光法的檢測值
會低于實際的微生物量[9,171；但當(dāng)有食物殘渣和體液
及脫屑的細胞污染時，ATP檢測值就要高于實際的微
生物含量【l引。此外，ATP檢測值還受到化學(xué)消毒劑或
洗滌劑的影響【71。在檢測人工污染的大腸桿菌時，因
接種大腸桿菌的程序復(fù)雜，大腸桿菌對濕度的要求
較高，使大腸桿菌的接種回收率較低(實驗數(shù)據(jù)未公
布)。而此時大腸桿菌中的ATP含量可能仍處于較高
狀態(tài)，因此，A和B公司的生物發(fā)光檢測儀對餐飲具
上大腸桿菌的檢出限低于對菌液的檢出限。
ATP生物發(fā)光檢測儀在對餐飲具進行實時監(jiān)
控方面能夠發(fā)揮重要作用，但不同儀器間的性能
存在較大差異，并且其檢測值受到諸多因素的影
響，很難制定統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。因此，在目前情況下，
ATP生物發(fā)光法還不能替代食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB
4789．2．2010中的傳統(tǒng)平板計數(shù)法來評價餐飲具的
微生物污染狀況。
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(責(zé)任編輯：楊翠娜)
／
張鳳蘭，博士，副研究員，主要研究方
向為食品化妝品安全性評價。
E-mail：flzhan92007@163．com
崔生輝，博士，研究員，主要研究方向
為食品微生物。
E—mail：cuishenghui@aliyun．tom

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