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三聚氰胺ELISA試劑盒在食品檢測(cè)中的檢測(cè)效果研究

文檔作者：謝體波1, 李平1 易重任1, 劉天雷1, 羅貴昆1, 何方洋1,2 文檔來源： 1. 貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司 2. 北京勤邦生物技術(shù)有限公司		點(diǎn) 擊數(shù)：	更新時(shí)間： 2025年06月30日
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第6 卷 第3 期 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào) Vol. 6 No. 3
2015 年3 月 Journal of Food Safety and Quality Mar. , 2015
基金項(xiàng)目: 2013 創(chuàng)新人才計(jì)劃項(xiàng)目(筑科合同[2013]209-01); 貴州省技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目;
Fund: Supported by 2013 Innovative Talents Scheme([2013]209-01); Guizhou Technology Innovation;
*通訊作者: 李平, 中級(jí)工程師, 主要從事食品安全快速檢測(cè)技術(shù)的研究與開發(fā). E-mail: 294173456@qq.com
*Corresponding author: Li Ping, Intermediate Engineer, Guizhou Kwinbon Food Safety Science-Technology Co., Ltd., Guiyang 550009, China.
E-mail: 294173456@qq.com
三聚氰胺 ELISA 試劑盒在食品檢測(cè)中的
檢測(cè)效果研究
謝體波1, 李 平1*, 易重任1, 劉天雷1, 羅貴昆1, 何方洋1,2
(1. 貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司, 貴陽 550009; 2. 北京勤邦生物技術(shù)有限公司, 北京 100012)
摘要: 目的為驗(yàn)證本公司生產(chǎn)的三聚氰胺ELISA 檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)效果。方法 用酶聯(lián)免疫法對(duì)牛奶、
奶粉、雞肉和雞蛋等4 種樣品中三聚氰胺的殘留量進(jìn)行檢測(cè), 并與高效液相色譜法進(jìn)行對(duì)照。結(jié)果 結(jié)果表明:
該試劑盒對(duì)4 種樣品的最低檢測(cè)限分別為19.22、46.86、51.64、21.38 μg/kg, 試劑盒板內(nèi)板間變異系數(shù)均小
于10%; 對(duì)4 種樣品做加標(biāo)回收試驗(yàn), 其回收率均在95%~120%之間, 變異系數(shù)均小于10%; 該方法與高效液
相色譜法檢測(cè)實(shí)際樣品的陰、陽性判斷結(jié)果一致。結(jié)論 該方法穩(wěn)定、可靠, 可滿足食品中三聚氰胺殘留快速
檢測(cè)的需要。
關(guān)鍵詞: 三聚氰胺; 酶聯(lián)免疫法; 高效液相色譜法; 檢測(cè)
Research on detection results of melamine enzyme-linked immune
sorbent assay detection kit in food
XIE Ti-Bo1, LI Ping1*, YI Zhong-Ren1, LIU Tian-Lei1, LUO Gui-Kun1, HE Fang-Yang1,2
(1. Guizhou Kwinbon Food Safety Science-Technology Co., Ltd., Guiyang 550009, China; 2. Beijing Kwinbon
Biotechnology Co., Ltd., Beijing 100012, China)
ABSTRACT: Objective To verify the test effect of melamine enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA)
detection kit developed by Beiijng Kwinbon Biotechnology company. Methods The method of ELISA was
used to detect the residues of melamine in milk, milk powder, chicken and eggs, and compared with that of high
performance liquid chromatography (HPLC). Results The results showed that the minimum detection
limitation of the kit for the 4 kinds of samples were 19.22, 46.86, 51.64, 21.38 μg/kg, the coefficient of
variation was less than 10%. The recovery of the method was in the range of 95%~120%, and the coefficient of
variation was less than 10%. The ELISA’s judgments of positive and negative were the same as the HPLC’s.
Conclusion This method was efficient, reliable and sensitive, and could meet the fast-tested for the
determination of melamine residues in food.
KEY WORDS: melamine; enzyme linked immune sorbent assay; high performance liquid chromatography;
detection
第3 期 謝體波, 等: 三聚氰胺ELISA 試劑盒在食品檢測(cè)中的檢測(cè)效果研究 1017
1 引 言
三聚氰胺俗稱密胺、蛋白精, 是一種三嗪類含氮
雜環(huán)有機(jī)化合物, 因其分子中含有大量氮元素, 一些
不法商家利用該特點(diǎn)向食品中添加三聚氰胺來提高
蛋白質(zhì)含量, 但其具有腎毒性[1-3], 長(zhǎng)期攝入可導(dǎo)致
腎衰竭、腎結(jié)石等[4], 并可誘發(fā)膀胱癌。目前, 針對(duì)
乳制品及其他食品中三聚氰胺殘留量的檢測(cè)方法主
要有高效液相色譜法(HPLC)[5,6]、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜
法(LC-MS/MS) [7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS) [8]
等, 但這些方法通常需要昂貴的儀器和高素質(zhì)的檢驗(yàn)
人員, 而且檢測(cè)成本較高, 會(huì)浪費(fèi)大量人力、物力[9];
這些因素限制了大型儀器檢測(cè)方法的大面積推廣和
批量檢測(cè), 不便于終端消費(fèi)者進(jìn)行快速篩選和診斷。
快速檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法, 膠體金免疫層析
法等, 其中酶聯(lián)免疫法是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、
重復(fù)性好的檢測(cè)方法[10], 具有操作方便、成本較低等
優(yōu)點(diǎn), 被廣泛應(yīng)用于食品中殘留三聚氰胺檢測(cè)。市場(chǎng)
上針對(duì)三聚氰胺快速檢測(cè)的進(jìn)口試劑盒主要有美國(guó)
Rome Labs、Abraxis、Beacon 及Strategic Diagnostics
公司的產(chǎn)品[11], Beacon 公司生產(chǎn)的試劑盒的檢測(cè)結(jié)
果略高于HPLC方法的檢測(cè)結(jié)果[12], Rome Labs 公司
的試劑盒檢出限為9 ng/mL; 國(guó)內(nèi)也有許多用于食
品中三聚氰胺或三聚氰酸殘留檢測(cè)的試劑盒, 例如,
北京維德維康生物技術(shù)有限公司及農(nóng)科院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
與檢測(cè)技術(shù)研究所開發(fā)的試劑盒, 但這些試劑盒在
三聚氰胺類似檢測(cè)及相關(guān)性能評(píng)估方面的數(shù)據(jù)較
少[13]。
為驗(yàn)證本公司生產(chǎn)的三聚氰胺酶聯(lián)免疫檢測(cè)試
劑盒的檢測(cè)效果, 本研究采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法對(duì)
牛奶等4 種樣品中三聚氰胺殘留量進(jìn)行檢測(cè), 并與高
效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)照, 以期為我國(guó)食品
安全快速檢測(cè)方面提供一些簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)
方法。結(jié)果表明, 我公司生產(chǎn)的試劑盒回收率在
95%~120%, 損失較少, 檢測(cè)牛奶樣品的靈敏度為
0.5 mg/kg, 比國(guó)內(nèi)一些試劑盒的靈敏度高(10-6)[13]。
2 材料與方法
2.1 材 料
2.1.1 樣品與試劑
牛奶、奶粉、雞肉、雞蛋均為市售; 三聚氰胺
(Melamine)ELISA 檢測(cè)試劑盒(北京勤邦生物技術(shù)有
限公司); 乙腈、濃鹽酸、甲醇、丙酮(分析純, 天津
市富宇精細(xì)化工有限公司)。
2.1.2 儀器與設(shè)備
微孔板酶標(biāo)儀(KHB ST-360, 上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)
有限公司), 振蕩器(SHA-C, 金壇市白塔金昌實(shí)驗(yàn)儀
器廠), 渦旋儀(QL-901, 海門市其林貝爾儀器制造有
限公司), 離心機(jī)(DT5-2, 北京時(shí)代北利離心機(jī)有限
公司), 勻漿機(jī)(MJ-BL2504, 美的), 天平(ESJ200-4,
沈陽龍騰電子有限公司), 微量移液器(Thermo)。
2.2 方法
2.2.1 樣品前處理方法
(1) 牛奶樣品前處理方法
移取400 μL 牛奶樣本至2 mL 聚苯乙烯離心管
中, 加入800 μL 乙腈, 用渦旋儀渦動(dòng)1 min, 3000 g
以上, 室溫(20~25 ℃)離心5 min; 移取100 μL 上清
液至2 mL 聚苯乙烯離心管中, 加入500 μL 復(fù)溶工作
液, 用渦旋儀渦動(dòng)1 min, 混勻; 取50 μL 用于分析。
(2) 奶粉樣品前處理方法
稱取(1.0±0.05) g 奶粉樣本至10 mL 聚苯乙烯離
心管中, 加入2.5 mL 去離子水, 用振蕩器振蕩3 min
至奶粉完全溶解; 移取400 μL 樣本液至2 mL 聚苯乙
烯離心管中, 分別加入400 μL 乙腈、400 μL 甲醇, 用
渦旋儀渦動(dòng)1 min, 3000 g 以上, 室溫(20~25 ℃)離心
5 min; 移取100 μL 上清液至2 mL 聚苯乙烯離心管
中, 加入500 μL 復(fù)溶工作液, 用渦旋儀渦動(dòng)1 min,
混勻; 取50 μL 用于分析。
(3) 雞肉樣品前處理方法
稱取(1.0±0.02) g 組織樣本至50 mL 聚苯乙烯離
心管中; 分別加入2 mL 丙酮、2 mL 去離子水, 用振
蕩器振蕩5 min, 3000 g 以上, 室溫(20~25 ℃)離心5
min; 移取100 mL 上清液至2 mL 聚苯乙烯離心管中,
加入900 mL 復(fù)溶工作液, 用渦旋儀渦動(dòng)1 min, 混勻;
取50 mL 用于分析。
(4) 雞蛋樣品前處理方法
稱取(1.0±0.05) g 雞蛋樣本至50 mL 聚苯乙烯離
心管中, 分別加入4.5 mL 去離子水、0.5 mL 甲醇, 用
振蕩器振蕩5 min, 3000 g 以上, 室溫(20~25 ℃)離心
10 min; 移取100 μL 上清液至2 mL 聚苯乙烯離心管
中, 再加入300 μL 復(fù)溶工作液用渦旋儀渦動(dòng)1 min,
混勻; 取50 mL 用于分析。
1018 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào) 第6 卷
2.2.2 樣品檢測(cè)方法
所有試劑與酶標(biāo)板放在實(shí)驗(yàn)桌上回溫至室溫
(20~25) ℃, 試劑搖勻; 將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品編號(hào), 每樣
做2 個(gè)平行; 取50 μL 樣品(標(biāo)準(zhǔn)品)加入到對(duì)應(yīng)微孔
中, 再加入酶標(biāo)二抗和抗體工作液50 μL, 震蕩搖勻,
用蓋板膜蓋板后于25 ℃避光反應(yīng)30 min; 揭開蓋板
膜, 將孔內(nèi)液體甩干, 加入洗滌工作液250 μL, 充分
洗滌4~5 次, 每次間隔10 s, 倒掉洗滌液, 用吸水紙
拍干; 每孔加入50 μL 底物液A 液和B 液, 震蕩搖勻
后用蓋板膜蓋板置于25 ℃避光反應(yīng)15 min; 反應(yīng)后
加入終止液50 μL, 震蕩搖勻, 設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm
處, 測(cè)定每孔OD 值。
2.2.3 三聚氰胺濃度的計(jì)算
百分吸光率的計(jì)算, 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品百分吸光率
等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的吸光度值的平均值除以第一
個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品(0 ppb) 的吸光度值的平均值, 再乘以
100%, 即
百分吸光率(%)=B/B0×100%
B—標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液的平均吸光度值
B0—0ppb 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
將樣品的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中, 從標(biāo)準(zhǔn)
曲線上讀出樣品所對(duì)應(yīng)濃度, 乘以其對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)
即為樣品中三聚氰胺實(shí)際濃度。
2.2.4 試劑盒相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)方法
分別對(duì)試劑盒的檢測(cè)限、精密度、準(zhǔn)確度進(jìn)行試
驗(yàn), 并將靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度與HPLC 檢測(cè)的靈
敏度、精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行對(duì)比。
(1)試劑盒檢測(cè)限測(cè)定方法
分別對(duì)20 份空白牛奶、奶粉、雞肉、雞蛋樣品
進(jìn)行檢測(cè), 計(jì)算三聚氰胺濃度, 以20 份樣品中三聚
氰胺濃度的平均值( X )和標(biāo)準(zhǔn)差(S)來表示檢測(cè)限
(LOD), 即LOD=( X )+3S, 為試劑盒檢測(cè)限。
(2)試劑盒精密度測(cè)定方法
取10 個(gè)試劑盒, 每盒隨機(jī)取1 塊酶標(biāo)板, 每塊
酶標(biāo)板中隨機(jī)抽取20 個(gè)微孔, 測(cè)定9 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液
的吸光度值(OD), 計(jì)算變異系數(shù)。
(3)樣品準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定方法
向空白樣品中加入三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品, 使牛奶中
三聚氰胺終濃度為0.5、1.0、2.0 mg/kg, 奶粉、雞肉
和雞蛋中三聚氰胺終濃度為1.0、2.5、5.0 mg/kg; 每
種樣品、每個(gè)濃度均5 個(gè)平行, 按2.2.2 操作方法測(cè)
定, 分別計(jì)算板內(nèi)、板間變異系數(shù)及回收率。
2.2.5 儀器測(cè)定方法
參照國(guó)標(biāo)GB/T 22288-2008、GB 29704-2013 和
GB/T 22388-2008[14-16]。
3 結(jié)果與分析
3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
分別測(cè)定0、1、3、9、27、81 ppb 標(biāo)準(zhǔn)品的吸
光度值, 以三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo), 三
聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品的百分吸光率為縱坐標(biāo), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲
線。以三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),
ln[B/(B0-B)]為縱坐標(biāo)建立雙對(duì)數(shù)直線擬合曲線, 數(shù)
學(xué)模型為ln[B/(B0-B)]=a+blogC。從圖1 和圖2 中可
知, 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為: Y= -2.134X+1.243, R2=0.996;
說明三聚氰胺的ELISA 檢測(cè)試劑盒線性關(guān)系良好。
圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線
Fig. 1 The standard curve
圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程
Fig. 2 Standard curve equation
3.2 試劑盒檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果
按照2.2.4 方法, 得到三聚氰胺ELISA 檢測(cè)試劑
盒對(duì)牛奶、奶粉、雞肉、雞蛋樣品的檢測(cè)限如表1, 從
第3 期 謝體波, 等: 三聚氰胺ELISA 試劑盒在食品檢測(cè)中的檢測(cè)效果研究 1019
表中結(jié)果可知, 該試劑盒對(duì)牛奶、奶粉、雞肉、雞蛋
幾種樣品的最低檢測(cè)限分別為19.22、46.86、21.38、
51.64 μg/kg, 遠(yuǎn)低于國(guó)際食品法典委員會(huì)對(duì)嬰兒配
方奶粉 (≤1 mg/kg)和其他食品中(≤2.5 mg/kg)的限
量要求, 說明該試劑盒靈敏度較高。
3.3 試劑盒精密度測(cè)定結(jié)果
酶標(biāo)板精密度測(cè)定結(jié)果如表2, 從表中可知, 三
聚氰胺ELISA 檢測(cè)酶標(biāo)板的板內(nèi)變異系數(shù)在1%~5%
范圍內(nèi), 板內(nèi)板間變異系數(shù)均小于10%, 說明該試劑
盒重現(xiàn)性較好, 性能較為穩(wěn)定。
3.4 樣品準(zhǔn)確度和精密度的測(cè)定結(jié)果
向牛奶、奶粉、雞肉、雞蛋四種空白樣品中分別
添加不同濃度的三聚氰胺, 每個(gè)濃度各5 個(gè)平行, 同
時(shí)做空白對(duì)照, 按2.2.4 操作方法測(cè)定。分別計(jì)算標(biāo)
準(zhǔn)偏差及回收率, 從表3 中可知, 四種樣品回收率均
在95%~120%之間, 變異系數(shù)均小于10%, 符合《農(nóng)
業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]17 號(hào)附件2 中試劑盒備案參
考證券標(biāo)準(zhǔn)中第4 點(diǎn)關(guān)于精密度和準(zhǔn)確度的規(guī)定, 說
明該三聚氰胺ELISA 檢測(cè)試劑盒精密度良好。
3.5 ELISA 試劑盒與高效液相色譜(HPLC)法
檢測(cè)結(jié)果比較
3.5.1 靈敏度比較
隨機(jī)抽取市售牛奶、奶粉、雞肉和雞蛋樣品各5
份, 分別用ELISA 試劑盒和高效液相色譜測(cè)定樣品
中三聚氰胺殘留量, 由表4 可知, ELISA 試劑盒檢測(cè)
結(jié)果與儀器檢測(cè)結(jié)果復(fù)核率為100%, 說明ELISA 檢
測(cè)試劑盒靈敏度較高; 檢測(cè)20 個(gè)樣品中三聚氰胺殘
留量均未超標(biāo), 合格率達(dá)到100%, 說明相關(guān)部門已
經(jīng)加大對(duì)食品安全監(jiān)管力度, 違法現(xiàn)象大大減少, 保
障人民食品安全和健康。
3.5.2 準(zhǔn)確度和精密度比較
在同等條件下, 對(duì)空白牛奶樣品做三聚氰胺添
加量為0.5 mg/kg 的添加回收試驗(yàn)(其中, ELISA 試劑
盒檢測(cè)方法中, 隨機(jī)選取3 塊酶標(biāo)板, 每塊板做4 個(gè)
平行), 比較ELISA 試劑盒和高效液相色譜法回收率
和變異系數(shù), 由表5 可知, 儀器檢測(cè)方法的回收率在
表1 檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果
Table 1 Result of detection limit
樣品
(samples)
三聚氰胺濃度
均值( X )
標(biāo)準(zhǔn)差
(S)
最低檢測(cè)限
LOD(μg/kg(L))
牛奶 18.66 0.19 19.22
奶粉 45.78 0.36 46.86
雞肉 20.38 0.34 21.38
雞蛋 50.63 0.34 51.64
表2 精密度結(jié)果
Table 2 Results of accuracy
酶標(biāo)
板號(hào)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
CV% 2.42 3.86 1.34 3.38 3.10 1.25 1.79 1.57 1.08 1.57
表3 樣品準(zhǔn)確度與精密度測(cè)定結(jié)果
Table 3 Results of precision and accuracy on samples
分類 加標(biāo)量, mg/kg(L) 測(cè)定均值, mg/kg(L) 標(biāo)準(zhǔn)差 回收率/% CV/%
牛奶
0.5 0.50 0.01 99.12 1.63
1.0 1.07 0.05 106.70 4.44
2.0 2.04 0.05 101.92 2.67
奶粉
1.0 1.03 0.07 102.66 6.97
2.5 2.47 0.13 98.64 5.11
5.0 5.15 0.10 103.00 1.96
雞蛋
1.0 1.07 0.07 107.40 6.13
2.5 2.50 0.08 100.08 3.08
5.0 5.08 0.09 101.52 1.87
雞肉
1.0 0.98 0.02 98.00 2.28
2.5 2.53 0.11 101.12 4.39
5.0 5.36 0.22 107.28 4.08
1020 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào) 第6 卷
表4 ELISA 試劑盒與儀器方法靈敏度比較(mg/kg(L))
Table 4 Comparison of sensitivity between ELISA kit and HPLC (mg/kg(L))
樣品 方法 1 2 3 4 5
牛奶
ELISA 0.25 0.56 0.73 0.82 0.13
HPLC 0.16 0.52 0.63 0.85 0.11
奶粉
ELISA 1.01 0.97 0.53 1.21 0.87
HPLC 0.98 1.03 0.57 1.17 0.91
雞蛋
ELISA 1.38 1.56 2.13 1.02 0.83
HPLC 1.35 1.48 2.07 0.89 0.91
雞肉
ELISA 1.01 1.32 1.79 1.06 0.13
HPLC 1.21 1.16 1.65 0.97 0.19
表5 ELISA 試劑盒與儀器方法精密度和準(zhǔn)確度比較
Table 5 Comparison of precision and accuracy between ELISA kit and HPLC
分類 三聚氰胺的回收率/% 平均回收率/% 變異系數(shù)CV/%
ELISA
99.70 103.33 97.78 98.99
98.56 99.34 101.56 109.23 102.19 3.74
104.78 103.22 109.98 99.78
HPLC 96.78 105.38 98.23 96.89 99.32 4.12
96.78%~105.38%, 平均回收率為99.32%, 變異系數(shù)
為4.12%; 同樣添加濃度, ELISA 試劑盒的回收率在
97.78%~109.98%之間, 平均回收率為102.19%, 試劑
盒板間變異系數(shù)為3.74%; ELISA 法和HPLC 法測(cè)定
結(jié)果基本一致, 符合度基本達(dá)到100％, 適用于牛奶
樣品中三聚氰胺殘留檢測(cè)。
4 結(jié) 論
本研究采用酶聯(lián)免疫法對(duì)牛奶、奶粉、雞肉和雞
蛋4 種樣品中三聚氰胺殘留量進(jìn)行檢測(cè), 驗(yàn)證本公司
生產(chǎn)的三聚氰胺ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)效果, 并將
其檢測(cè)效果與儀器檢測(cè)方法做對(duì)照。結(jié)果表明, 三聚
氰胺ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)靈敏度較高, 對(duì)牛奶、
奶粉、雞肉、雞蛋樣品最低檢測(cè)限較低, 遠(yuǎn)低于國(guó)家
規(guī)定最高殘留量; 與高效液相色譜檢測(cè)法相比, 檢測(cè)
結(jié)果一致, 且試劑盒檢測(cè)用時(shí)短(30 min), 樣品前處
理方法簡(jiǎn)單, 操作方便, 檢測(cè)設(shè)備投入少, 耗能低,
可滿足對(duì)奶粉等樣品中殘留三聚氰胺的快速檢測(cè)。
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(責(zé)任編輯: 李振飛)
作者簡(jiǎn)介
謝體波, 中級(jí)工程師, 主要從事食品
安全快速檢測(cè)技術(shù)的研究與開發(fā)。
E-mail: 394736614@qq.com
李平, 中級(jí)工程師, 主要從事食品安
全快速檢測(cè)技術(shù)的研究與開發(fā)。
E-mail: 294173456@qq.com

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